塞來昔布聯(lián)合放療對人膽管癌細(xì)胞凋亡的作用研究

王陽 鄒明雷 呂晶晶 付培彪

[摘要] 目的 研究人膽管癌細(xì)胞在塞來昔布和放療作用下發(fā)生凋亡的作用機(jī)制。 方法 將QBC939細(xì)胞株分為四組：對照組、塞來昔布組（C組）、放療組（R組）和塞來昔布聯(lián)合放療組（C+R組，聯(lián)合組），分別進(jìn)行不同濃度的塞來昔布和不同劑量X線作用后，采用CCK-8法、流式細(xì)胞技術(shù)和Western blot等方法分別檢測各組細(xì)胞生長、凋亡率及survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 聯(lián)合組的凋亡率明顯增加，從3.527%升至23.364%（P<0.05），survivin蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。 結(jié)論 應(yīng)用塞來昔布對接受放療的人QBC939細(xì)胞株有凋亡增敏作用，下調(diào)survivin的表達(dá)是其機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 塞來昔布；膽管細(xì)胞癌；放療；survivin基因

[中圖分類號] R735.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）10-0019-03

膽管細(xì)胞癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因其解剖位置特殊，早期診斷較困難，可手術(shù)切除的患者不到20%，放化療是中晚期患者主要治療手段，但放療效果受到腫瘤敏感性的限制。塞來昔布作為一種COX-2抑制劑，在近年研究中被認(rèn)為具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[1，2]。本研究探討體外條件下塞來昔布對接受X線放療的人QBC939細(xì)胞凋亡的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及細(xì)胞培養(yǎng)

QBC939人膽管癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，塞來昔布購自南京德寶生化有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，兔抗人survivin多克隆抗體及β-actin購自Santa-Cruz公司，CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物科技研究所。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究時(shí)間2012年1月～2013年1月。

1.2 CCK-8法檢測細(xì)胞生長

取傳代培養(yǎng)的對數(shù)生長期QBC，939細(xì)胞制成1×105個(gè)/L細(xì)胞懸液，種植在96孔板中，每孔100 μL。設(shè)為調(diào)零組（不含細(xì)胞的培養(yǎng)液），對照組（常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，不接受塞來昔布及放療），實(shí)驗(yàn)組（分別加入濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞來昔布，X線放療劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy），實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后實(shí)驗(yàn)組每孔加CCK-8試劑10 μL，再培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定每孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并進(jìn)一步計(jì)算出塞來昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇濃度65 μmol/L塞來昔布。X線放療的IC50為5.83 Gy，選擇劑量6 Gy用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

將實(shí)驗(yàn)分為四組，每組樣本數(shù)為10，分組設(shè)置如下：對照組單純培養(yǎng)細(xì)胞；塞來昔布組（C組）加入濃度65 μmol/L塞來昔布；放療組（R組）給予劑量6 Gy X線照射；塞來昔布聯(lián)合放療組（C+R組）先給予濃度65 μmol/L塞來昔布24 h后更換培養(yǎng)液，再給予劑量6 Gy的X線照射細(xì)胞，各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并離心，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測，凋亡細(xì)胞的比例由Cell Quest Pro 軟件計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot蛋白檢測

收集上述各組細(xì)胞，每組樣本數(shù)為10，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，調(diào)整各組總蛋白，使各組總蛋白濃度相同。經(jīng)15%SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后加入一抗（兔抗人survivin多克隆抗體），工作濃度為1∶1000，再加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體），工作濃度為1∶6000。同樣方法進(jìn)行內(nèi)參蛋白（β-actin）的抗體孵育。發(fā)光、顯影、定影后制成膠片，掃描后用凝膠圖像處理體統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的凈光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的凋亡率

如圖1所示每組細(xì)胞的流式圖，結(jié)果顯示聯(lián)合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組（P<0.05，見表1）。結(jié)合圖1及表1結(jié)果，推斷塞來昔布對QBC939的X線放療有增敏作用。

2.2 Survivin蛋白的表達(dá)

聯(lián)合組survivin蛋白表達(dá)較其他各組要明顯減弱（圖2），用相關(guān)軟件計(jì)算出各條帶的灰度值，將目的蛋白survivin/β-actin灰度值作為最終結(jié)果，以x±s表示（表1），多組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示聯(lián)合組survivin蛋白表達(dá)下降，從而加速細(xì)胞凋亡。

3 討論

放射療法作為治療腫瘤的一種傳統(tǒng)手段，其療效受到腫瘤放療敏感性的限制。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分腫瘤對輻射并不敏感，在很大程度上影響了放療效果。如何通過提高腫瘤的放射敏感性以提高放療療效，是近年來研究的熱門之一。塞來昔布是一種環(huán)氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑，其放射增敏作用在近年研究中受到重視[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶-2（COX-2）在上皮組織癌（包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、皮膚的鱗狀上皮細(xì)胞癌等）中廣泛存在且過度表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4]。COX-2促進(jìn)前列腺素E2（PGE2）生成，而PGE2具有放射保護(hù)作用，而放射治療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)COX-2[4，5]。塞來昔布屬于非甾體類抗炎藥（NSAIDs），是一種選擇性環(huán)氧化酶抑制劑，可通過抑制環(huán)氧化酶-1及環(huán)氧化酶-2來阻止花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化，從而阻止PGE2的放射保護(hù)作用，發(fā)揮放射增敏劑的作用。研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布作為一種新型COX-2選擇性抑制劑，可明顯降低消化道腫瘤的發(fā)病率[4]，塞來昔布通過抑制腫瘤細(xì)胞放射損傷的修復(fù)，改變腫瘤細(xì)胞的周期分布，抑制腫瘤新生血管形成以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等機(jī)制，在聯(lián)合放射治療可提高放療療效，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放射的敏感性[5-7]。聶亮琴[7]等將正常少突膠質(zhì)細(xì)胞（oln93）及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（u373）分別按空白處理、單獨(dú)接受塞來昔布或X射線、塞來昔布聯(lián)合X射線4種不同處理方式研究塞來昔布的放射增敏作用及其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)塞來昔布能抑制oln93細(xì)胞和u373細(xì)胞生長，膠質(zhì)瘤細(xì)胞組放射增敏比高于正常膠質(zhì)細(xì)胞組，并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯，聯(lián)合組與照射組比較，u373細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE1l蛋白表達(dá)下降，提示塞來昔布對u373的放射增敏作用比oln93細(xì)胞明顯，其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布及DNA損傷修復(fù)有關(guān)。

Survivin基因作為凋亡抑制家族的重要成員，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制基因，survivin表達(dá)與腫瘤預(yù)后、放化療敏感性密切相關(guān)[8-11]。survivin與環(huán)氧化酶-2表達(dá)的關(guān)系是塞來昔布作用機(jī)制研究的方向之一。夏歷[12]等研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中survivin的表達(dá)與COX-2相關(guān)。李偉忠等[13]通過研究環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞COX-2、survivin表達(dá)的影響及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)塞來昔布下調(diào)survivin mRNA及其蛋白表達(dá)的同時(shí)抑制COX-2蛋白的表達(dá)，但對COX-2 mRNA表達(dá)的抑制作用較弱，提示COX-2抑制劑塞來昔布下調(diào)survivin表達(dá)的作用可能與抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用有關(guān)。方雷[14]等通過設(shè)計(jì)合成survivin 的 siRNA 序列并轉(zhuǎn)染等方式研究survivin基因沉默對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及對化療藥物塞來昔布敏感性的影響，發(fā)現(xiàn) survivin基因沉默48 h后，MGC-803細(xì)胞的survivin基因和蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），survivin基因沉默組細(xì)胞對塞來昔布的敏感性顯著增強(qiáng)，提示survivin特異性siRNA能顯著沉默MGC-803細(xì)胞survivin基因，抑制細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞對塞來昔布的敏感性。

使用塞來昔布來降低survivin的表達(dá)從而增加放療的敏感性是本研究的設(shè)想之一。有研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中，PGE2可以激活EGFR/PI3K途徑，通過EP1受體來上調(diào)survivin的表達(dá)[15]。本研究中，Western blot法檢測到survivin蛋白的表達(dá)在聯(lián)合組中明顯下降，提示在QBC939細(xì)胞株中，塞來昔布可以加速survivin蛋白的分解或降低survivin的mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組，由此我們可以推斷，塞來昔布可以下調(diào)survivin表達(dá)，發(fā)揮放療增敏作用。

本研究通過塞來昔布聯(lián)合放療作用于人膽管癌QBC939細(xì)胞株，顯示塞來昔布能增強(qiáng)放療的敏感性，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制之一可能是抑制survivin表達(dá)。本研究對膽管癌的治療提供了一種新思路，但是仍需更多研究來證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 許燕艷，翟鳳鈺，王亞帝，等. 塞來昔布聯(lián)合多西他賽抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用研究[J]. 中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16（3）：1004-1007.

[2] 周任，張龍洲，王睿智. 塞來昔布對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡和Survivin表達(dá)的影響[J]. 癌癥，2010，29（3）：316-322.

[3] 牛國梁，王輝，謝榮俊，等. 選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對乳腺癌的放療增敏作用及其機(jī)制研究[J]. 腫瘤學(xué)雜志，2011，17（3）：172-176.

[4] 周海存，劉宏斌. 塞來昔布防治胃癌的機(jī)制及應(yīng)用前景[J].中華消化外科雜志，2013，（4）：317-320.

[5] Davis TW，O'Neal JM，Pagel MD，et al. Synergy between celecoxib and radiotherapy results from inhibition of cyclooxygenase-2-derived prostaglandin E2，a survival factor for tumor and associated vasculature[J]. Cancer Res，2004，64（1）：279-285.

[6] Milas L. Cyclooxygenase-2 （COX-2） enzyme inhibitors and radiotherapy： Preclinical basis[J]. Am J Clin Oncol，2003， 26（4）：66-69.

[7] 聶亮琴，周菊英，王利利. 塞來昔布對正常腦膠質(zhì)細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射增敏效應(yīng)的比較及其機(jī)制[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2014，34（5）：342-344，375.

[8] 盧浩，劉士維，張偉. 凋亡抑制因子 Survivin 的研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2014，54（21）：100-101.

[9] 朱正明，歐陽喜，羅洪亮，等. Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與結(jié)腸癌易感性及臨床意義的相關(guān)性[J]. 世界華人消化雜志，2014，22（9）：1334-1340.

[10] 王璟，龐義存，趙向寨. survivin基因在絨毛膜癌細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、凋亡的影響[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49（6）：466-468.

[11] 王平，董德平，張建平.下調(diào)survivin基因?qū)Π螂啄蚵飞掀ぐ㏕24細(xì)胞增生和凋亡的影響[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（12）： 2521-2524.

[12] 夏歷，謝小兵，寧興旺. Survivin和COX-2在胃癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（10）：1916-1919.

[13] 李偉忠，王曉燕，霍秋菊. 塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞survivin表達(dá)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（5）：543-545.

[14] 方雷，吳海濱，陳曉崗. Survivin 基因沉默抑制胃癌 MGC-803 細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其對塞來昔布的敏感性[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（11）：1944-1948.

[15] Bai XM，Jiang H，Ding JX，et al. Prostaglandin E2 upregulates survivin expression via the EP1 receptor in hepatocellular carcinoma cells[J]. Life Sciences，2010，（86）：214-223.

（收稿日期：2015-01-09）