金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒檢測分析

王書冉, 高艷芳， 張　良， 劉　洋， 萬　青， 呂　寧

(新鄭市疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，河南 新鄭451150)

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金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒檢測分析

王書冉, 高艷芳， 張良， 劉洋， 萬青， 呂寧

(新鄭市疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，河南 新鄭451150)

[摘要]目的探討金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測方法，為食物中毒處理提供依據(jù)。方法以食物樣本為實(shí)驗(yàn)材料， 按照GB/T4789.10-2003，對樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測及計(jì)數(shù)，并對相關(guān)腸毒素基因SEA、SEB、SECs進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行染色鏡檢，結(jié)果為革蘭陽性金黃色葡萄球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，菌落為8.5×107cfu/g，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本發(fā)現(xiàn)SEA、SEB、SECs基因。結(jié)論金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB、SECs基因可能是該例食物中毒的原因，加強(qiáng)金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢驗(yàn)是迫切需要解決的一個(gè)問題。

[關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌；腸毒素 ；食物中毒

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是引起人類食物中毒最常見的病原菌，產(chǎn)生的毒素主要有腸毒素、殺白細(xì)胞毒素、表皮剝脫毒素等，侵襲性酶類有血漿凝固酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶和溶纖維蛋白酶。一旦毒素在體內(nèi)大量集聚，可以造成炎癥反應(yīng)，如肺炎、心包炎、腸炎等，嚴(yán)重可造成多器官功能障礙。根據(jù)我國近年對食源性疾病的分析，大部分由金黃色葡萄球菌腸毒素引起[1]。筆者就新鄭市發(fā)生的1例由金葡菌的食源性中毒進(jìn)行分析，采用PCR方法檢測3種腸毒素基因(SEA、SEB、SECs)。

1材料和方法

1.1流行病學(xué)調(diào)查某人在食用不潔食物后，發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱等癥狀。 通過流行病學(xué)調(diào)查，確診為金黃色葡萄球菌污染引起的食物中毒。

1.2檢測方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本以送至新鄭市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢查的食物樣本為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、表皮葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2.3主要儀器及材料數(shù)控恒溫水浴槽、恒溫培養(yǎng)箱、低溫冷凍高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、營養(yǎng)肉湯、凍干血漿、新鮮羊血、PCR試劑、硼酸、溴化乙啶、EDTA。

1.2.4引物(1)SEA引物為： 5’-AGTCTGAATTGCAGGGAACAGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小288bp。(2)SEB引物為：5’-TAGTTATTTCTACACCCAACG -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小641bp。(2)SECs引物為：5’-TGGTGCAGGCATCATATCATACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小641bp。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇用0.5 mL BP溶解凍干株，移入增菌液中增菌，轉(zhuǎn)種于平板。

1.3.2金黃色葡萄球菌檢測按照GB/T4789.10-2003進(jìn)行，對樣品進(jìn)行金葡菌檢測并計(jì)數(shù)。

1.3.3DNA模板提取細(xì)菌 DNA后，從血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落，加入滅菌純水，100℃煮沸10分鐘，離心，取上清液。余標(biāo)準(zhǔn)菌株模板制備方法同上。

1.3.4PCR檢測分別對SEA、SEB、SECs基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以DL2000maker為標(biāo)準(zhǔn)，制備瓊脂糖，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳30 min，觀察電泳結(jié)果。

2結(jié)果

2.1染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)和菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行染色鏡檢，結(jié)果為革蘭陽性金黃色葡萄球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，菌落為8.5×107cfu/g。

2.2PCR試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本增出SEA、SEB、SECs基因。對照菌株未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。

3討論

典型的金葡菌為球形，無鞭毛，大多無莢膜，不能運(yùn)動(dòng)，金葡菌在普通的培養(yǎng)基上可良好生長，為兼性厭氧菌，有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，金葡菌腸毒素耐熱并且不受胰白酶的影響，在70℃水中1 h不能被殺死，在-10~15℃中不能被凍死，需要在100℃加熱2 h才能將其破壞。蔗糖或者含鹽豐富的食品才可抑制其生長[2]。金葡菌可分解葡萄糖、乳糖、蔗糖等有機(jī)物質(zhì)，部分菌種可水解尿素，還原硝酸鹽。金葡菌在環(huán)境中均可找到，在人體主要寄殖于鼻黏膜、腹股溝等部位，偶寄生于口咽部、腸道，人群為該病原菌的攜帶者。金葡菌腸毒素引起食物中毒的特征是潛伏期短。學(xué)者認(rèn)為金葡菌腸毒素作用于胃腸道神經(jīng)細(xì)胞受體，達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激嘔吐中樞，還可通過T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞因子導(dǎo)致嘔吐和腹瀉。此外T細(xì)胞被激活后，人體早期體液免疫IgM蛋白的合成受到抑制，加以巨噬細(xì)胞清除功能被抑制，細(xì)菌大量產(chǎn)生內(nèi)毒素，引起休克、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞壞死[3]。

因金葡菌產(chǎn)生的毒素和酶最多，分泌多種毒性蛋白質(zhì)，毒力強(qiáng)，是食品安全檢測衛(wèi)生中的重要檢測項(xiàng)目。這些毒性物質(zhì)中最主要的一種是葡萄球菌腸毒素，腸毒素是導(dǎo)致暴發(fā)性食物中毒的致病因子，人食入含1~20 μg腸毒素的食品就可致病。溫度適宜時(shí)，金葡菌在6~12 h大量繁殖產(chǎn)生腸毒素，污染食品引起食物中毒。

金葡菌的檢測手段主要有顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)、金葡菌快速測試方法、免疫學(xué)方法等。對于金葡菌腸毒素檢查，傳統(tǒng)采取動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，因非腸毒素類產(chǎn)物也可致幼貓嘔吐，特異性不高，很少使用[4]。金葡菌的富集培養(yǎng)，要使金葡菌數(shù)量達(dá)到一定可檢測水平，才能進(jìn)行金葡菌的分離，形態(tài)學(xué)觀察、理化鑒定，但結(jié)果只能定性不能定量。其他檢測金葡菌腸毒素的手段有免疫雙擴(kuò)法、反向間接血凝法 、固相放射免疫技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附等。目前分子生物學(xué)檢測技術(shù)高速發(fā)展，如核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基因芯片技術(shù)也廣泛開展。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)敏感性、特異性高，用于檢測金葡菌腸毒素的產(chǎn)毒基因[5]。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳蕾,賈偉平,陸俊莤,等.上海市金黃色葡萄球菌流行調(diào)查[J].中華感染病雜志,2013,31(12):909-912.

[2]張文治.新編食品微生物學(xué)[M].北京:中國輕工出版社,2014.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T4789-2003.中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[4]張蓓,沈立松.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)冊,2012,24(6):327-328.

[5]雷祚榮.葡萄球菌和葡萄球菌毒素病[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,2012.

[責(zé)任編校：張亞光]

[中圖分類號]R 155.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號]1008-9276(2015)06-0753-02

作者簡介：王書冉 (1971-)，女，河南省新鄭市人，本科，主管檢驗(yàn)師，從事衛(wèi)生檢驗(yàn)與微生物檢驗(yàn)工作。

收稿日期：2015-03-18