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    全反式維甲酸對(duì)宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及其分子機(jī)制研究

    2015-03-13 01:10胡海燕劉植華
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:侵襲轉(zhuǎn)移維甲酸

    胡海燕++++++劉植華

    [摘要] 目的 觀察全反式維甲酸(ATRA)對(duì)宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響,并探討其分子機(jī)制。 方法 分別用不同濃度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)處理對(duì)數(shù)生長期HeLa/MMC細(xì)胞,以Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化;采用CCK-8法檢測經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L ATRA處理后的細(xì)胞增殖情況;通過流式細(xì)胞儀觀察1×10-6 mol/L ATRA處理HeLa/MMC細(xì)胞3、7 d后細(xì)胞周期的變化;半定量RT-PCR檢測1×10-6 mol/L ATRA處理HeLa/MMC細(xì)胞3、7 d后細(xì)胞c-myc mRNA水平變化。 結(jié)果 ①Transwell小室結(jié)果顯示,1×10-7 mol/L ATRA組、1×10-6 mol/L ATRA組、1×10-5 mol/L ATRA組細(xì)胞侵襲數(shù)、轉(zhuǎn)移數(shù)[(40±6)、(73±7)個(gè),(26±4)、(61±4)個(gè),(16±3)、(49±5)個(gè))]均減少,與對(duì)照組[(63±9)、(89±9)個(gè)]比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。②CCK-8法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,隨著全反式維甲酸藥物濃度的遞增,HeLa/MMC細(xì)胞增殖逐漸被抑制;實(shí)驗(yàn)各組與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。③流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,全反式維甲酸使進(jìn)入S期耐藥細(xì)胞數(shù)減少。1×10-6 mol/L ATRA處理3、7 d S期細(xì)胞比例分別為(14.90±0.21)%、(6.48±0.18)%;兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(16.28±0.12)%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。④RT-PCR結(jié)果顯示,全反式維甲酸下調(diào)癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄。1×10-6 mol/L ATRA處理3、7 d c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.5406±0.0011)、(0.4312±0.0009);兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(0.6804±0.0012)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。 結(jié)論 全反式維甲酸可抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能通過下調(diào)癌基因c-myc轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)。

    [關(guān)鍵詞] 宮頸腫瘤;維甲酸;轉(zhuǎn)移;侵襲

    [中圖分類號(hào)] R737.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2015)02(c)-0018-04

    全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是由維生素A在人體內(nèi)代謝生成的高活性衍生物,對(duì)胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化以及機(jī)體的生長、發(fā)育均具有重要調(diào)節(jié)作用[1]。到目前為止,ATRA用于急性早幼粒白血病治療的基礎(chǔ)與臨床研究較為深入[2-3],而有關(guān)人體實(shí)體瘤的分化研究,已見報(bào)道的有結(jié)腸癌、胃癌、肺鱗狀上皮癌、乳腺癌等[4-5]。本課題組的前期研究顯示,ATRA能有效抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖并誘導(dǎo)其分化,且能提高宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC對(duì)化療的敏感性[6]。宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC較其親本細(xì)胞HeLa增殖更快、惡性度更高。本研究以宮頸癌耐絲裂霉素細(xì)胞株HeLa/MMC為研究對(duì)象,體外觀察ATRA對(duì)宮頸癌耐藥細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響,探討其作用的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    ATRA、二甲基亞砜(DMSO)、PI、CCK-8試劑盒、RNase(Sigma公司、美國)。Transwell小室(Corning公司、美國)。SV總RNA分離試劑盒(Promega公司、美國)。One step RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司、中國)。引物由中國上海Invitrogen公司合成。

    1.2 耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的建立

    耐藥細(xì)胞株由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤研究所惠贈(zèng)。通過連續(xù)性給藥,間歇性增加藥量,逐步提高宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中絲裂霉素濃度,獲得對(duì)絲裂霉素5.02倍耐藥,對(duì)順鉑2倍耐藥的HeLa/MMC細(xì)胞株。該細(xì)胞株對(duì)長春新堿、5-氟尿嘧啶、阿霉素保持敏感。

    1.3 方法

    1.3.1 耐藥細(xì)胞的培養(yǎng) HeLa/MMC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,培養(yǎng)液中加入絲裂霉素維持其耐藥性,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視細(xì)胞生長情況隔天換液1次,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3.2 Transwell小室檢測耐藥細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。細(xì)胞轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中,在Transwell小室的上室中加入100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),用無血清預(yù)冷的DMEM稀釋Matrigel膠(3∶1)。加30 μL稀釋的Matrigel于Transwell小室的上室,37℃放置過夜。上室加入100 μL細(xì)胞懸液,設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入三種濃度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)。下室中加入含有10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加入相應(yīng)體積培養(yǎng)液。置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出小室,用棉簽拭去小室內(nèi)細(xì)胞和Matrigel膠,PBS沖洗,10%甲醛固定15 min,PBS沖洗,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,清水沖洗后倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野(200×)計(jì)細(xì)胞數(shù),取其平均值。

    1.3.3 CCK-8法檢測耐藥細(xì)胞的增殖情況 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔5×103個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的ATRA(1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L),陰性對(duì)照組不加藥物,空白對(duì)照組無細(xì)胞,僅加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加含CCK-8 10 μL的完全培養(yǎng)基100 μL,繼續(xù)于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,用酶聯(lián)儀測450 nm處的OD值。

    1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期 用胰酶將1×10-6 mol/L ATRA分別作用3、7 d的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,預(yù)冷過的70%乙醇固定細(xì)胞,4℃冰箱保存。上流式細(xì)胞儀檢測前棄乙醇,加入RNA酶作用30 min,100 μg/mL PI染色液4℃避光染色30 min,細(xì)胞經(jīng)300目過濾網(wǎng)后上機(jī)檢測。各組測1×104個(gè)細(xì)胞,經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理得出細(xì)胞周期各時(shí)相百分比(%)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3.5 半定量RT-PCR分析耐藥細(xì)胞的c-myc基因表達(dá) 收集1×10-6 mol/LATRA分別作用3、7 d的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞,按SV總RNA分離試劑盒說明提取細(xì)胞RNA。引物序列設(shè)計(jì)如下:c-myc上游5'-CTC TCA ACG ACA GCA GCC CG-3',下游5'-AGG TGA TCC AGA CTC TGA CC-3';β-actin上游5'-CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGG GAC C-3',下游5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G-3'。擴(kuò)增DNA片段大?。篶-myc 250 bp,β-actin 600 bp。依據(jù)TaKaRa公司的one step RT-PCR試劑盒的操作說明,將反應(yīng)體系置于DNA循環(huán)儀中,42℃逆轉(zhuǎn)錄60 min,合成互補(bǔ)DNA。95℃預(yù)變性5 min,再進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)條件:95℃變性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸1 min。共計(jì)30個(gè)循環(huán)后,72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下檢測拍照記錄結(jié)果。采用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)掃描測定,以基因β-actin作為內(nèi)參照,計(jì)算c-myc mRNA的相對(duì)表達(dá)量并比較表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用one-way ANOVA做多組均數(shù)比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化

    Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力結(jié)果顯示:經(jīng)ATRA處理過的HeLa/MMC細(xì)胞侵襲數(shù)及轉(zhuǎn)移數(shù)均明顯減少,且隨著藥物濃度增加,細(xì)胞侵襲數(shù)及轉(zhuǎn)移數(shù)減少。與對(duì)照組比較,ATRA各濃度實(shí)驗(yàn)組的侵襲細(xì)胞數(shù)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。說明ATRA能抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞HeLa/MMC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。見表1。

    表1 全反式維甲酸對(duì)HeLa/MMC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響(個(gè),x±s)

    注:與陰性對(duì)照組比較,*P < 0.05

    2.2 CCK-8法測定耐藥細(xì)胞的增殖情況

    實(shí)驗(yàn)組經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L ATRA處理后的HeLa/MMC細(xì)胞,細(xì)胞增殖被抑制。ATRA在1×10-7 mol/L的低濃度下就有抑制耐藥細(xì)胞株增殖作用,與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),且隨著濃度遞增,抑制作用逐漸增強(qiáng)。ATRA抑制耐藥細(xì)胞增殖的作用存在一定的劑量依賴關(guān)系。見表2。

    表2 全反式維甲酸對(duì)HeLa/MMC細(xì)胞的生長抑制作用(x±s)

    注:與陰性對(duì)照組比較,*P < 0.05

    2.3 流式細(xì)胞儀檢測耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期的變化

    HeLa/MMC細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/L ATRA處理3 d后細(xì)胞周期分布的變化,表現(xiàn)在細(xì)胞堆積在G1/G0期,而進(jìn)入S期細(xì)胞相應(yīng)減少。與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。隨著ATRA藥物作用時(shí)間的延長,堆積在G1/G0期的細(xì)胞比例逐步升高,進(jìn)入S期的細(xì)胞比例相應(yīng)降低。提示ATRA能阻止HeLa/MMC細(xì)胞由G1/G0期進(jìn)入S期。見表3。

    表3 HeLa/MMC細(xì)胞周期分布(%,x±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P < 0.05;ATRA1實(shí)驗(yàn)組:1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d;ATRA2實(shí)驗(yàn)組:1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d

    2.4 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(圖1)均可見兩條基因片段:250 bp的c-myc(目的基因)和600 bp的β-actin(內(nèi)參基因)。經(jīng)1×10-6 mol/LATRA分別處理3、7 d后的HeLa/MMC細(xì)胞c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組減少(見圖1c、d)。

    a.marker;b.對(duì)照組;c.經(jīng)1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d實(shí)驗(yàn)組;d.經(jīng)1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d實(shí)驗(yàn)組

    圖1 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

    2.5 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段的半定量結(jié)果

    對(duì)照組細(xì)胞c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.6804±0.0012)。細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/LATRA處理3 d后的c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.5406±0.0011),低于對(duì)照組。細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/LATRA作用至7 d時(shí),c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量降至(0.4312±0.0009)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),這提示ATRA抑制了c-myc癌基因的轉(zhuǎn)錄。見表4。

    表4 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段半定量結(jié)果(x±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P < 0.05;ATRA1實(shí)驗(yàn)組:1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d;ATRA2實(shí)驗(yàn)組:1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d

    3 討論

    子宮頸癌是發(fā)生于宮頸上皮的惡性腫瘤,是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。發(fā)病率近年來呈上升趨勢,發(fā)病年齡趨于年輕化[7],危害年輕女性的生殖健康?;熆梢钥s小腫瘤病灶,控制轉(zhuǎn)移灶,在晚期宮頸癌的治療中占有重要地位[8-9]。而且術(shù)前的新輔助化療已可替代術(shù)前放療,提高手術(shù)成功率,同時(shí)避免放療引起女性卵巢功能的衰退。化療聯(lián)合手術(shù)、放療的綜合治療,對(duì)于晚期宮頸癌患者改善預(yù)后、延長患者生存時(shí)間非常重要。然而化療失敗的主要原因是患者化療過程中出現(xiàn)腫瘤耐藥,化療藥無法殺滅腫瘤細(xì)胞。而且治療過程中,容易出現(xiàn)腫瘤的播散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,影響患者預(yù)后。ATRA作為誘導(dǎo)分化劑,對(duì)于調(diào)節(jié)組織器官的功能和細(xì)胞的增殖、代謝、形態(tài)分化具有重要作用,以及調(diào)控機(jī)體生長發(fā)育以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[10]。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn),ATRA可抑制兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中血管平滑肌細(xì)胞的遷徙轉(zhuǎn)移,從而抑制兔頸動(dòng)脈管腔的狹窄。其作用的分子機(jī)制是下調(diào)c-myc的表達(dá)[11]。本研究旨在觀察ATRA對(duì)宮頸癌耐藥細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及癌基因c-myc轉(zhuǎn)錄水平的變化,探討ATRA應(yīng)對(duì)宮頸癌化療耐藥的可行性及其作用的分子靶點(diǎn)。

    惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是其區(qū)別于正常細(xì)胞的生物學(xué)特征,也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。本研究應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力結(jié)果顯示,ATRA可抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞HeLa/MMC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,隨著藥物濃度的遞增,腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移數(shù)減少。本研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度ATRA能抑制HeLa/MMC細(xì)胞增殖,降低其惡性度。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1×10-7~1×10-5 mol/L的ATRA對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞HeLa/MMC細(xì)胞的增殖有抑制作用,且這種抑制作用呈劑量依賴性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,ATRA將腫瘤耐藥細(xì)胞阻滯于G1期,使進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。這從另一個(gè)角度說明ATRA使腫瘤耐藥細(xì)胞阻滯于G1期,抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。

    已有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中存在癌基因的異常過表達(dá)[8]。不同學(xué)者研究證實(shí)人宮頸癌及癌旁組織均有c-myc基因擴(kuò)增,癌組織的擴(kuò)增倍數(shù)高于癌旁組織。c-myc基因的激活和異常表達(dá)與宮頸鱗狀上皮癌變過程密切相關(guān)[12]。筆者前期研究顯示,耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的惡性程度顯著高于宮頸癌細(xì)胞HeLa。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是個(gè)多階段、多步驟過程,受多個(gè)基因、多個(gè)信號(hào)分子在時(shí)間、空間效應(yīng)上的共同調(diào)節(jié)。經(jīng)典癌基因c-myc位于人8號(hào)染色體,其編碼的c-myc核蛋白,參與酪氨酸激酶信號(hào)通路,在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移腫瘤耐藥中起重要作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)ATRA下調(diào)耐藥細(xì)胞癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄。隨著ATRA作用時(shí)間的延長,HeLa/MMC細(xì)胞內(nèi)癌基因c-mycmRNA的水平逐漸降低。故推測,ATRA可能通過轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)HeLa/MMC細(xì)胞c-myc的表達(dá),發(fā)揮其抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯、抑制細(xì)胞增殖。由此,本研究認(rèn)為c-myc基因是ATRA發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵“靶點(diǎn)”基因。

    腫瘤化療耐藥是臨床治療惡性腫瘤的難點(diǎn),也是惡性腫瘤患者預(yù)后差的重要原因。鑒于ATRA能抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的侵襲、轉(zhuǎn)移,可以認(rèn)為ATRA是一種很有前景的治療耐藥宮頸惡性腫瘤的藥物,值得在其調(diào)控腫瘤耐藥細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及作用機(jī)制方面的進(jìn)一步深入研究。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2014-10-16 本文編輯:張瑜杰)

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