維甲酸對胎鼠骨骼致畸作用的研究

韓繼衛(wèi), 李秋霞, 夏 鵬, 孫 苗, 王冰烴, 鄭大恒

紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 紹興 312000

維生素A(vitamin A)又稱視黃醇，是脊椎動物胚胎時(shí)期細(xì)胞增殖、生長和分化的重要信號分子。動物通過食物攝入維生素A，并經(jīng)過兩步脫氫氧化為維甲酸(retinoic acid，RA)，維甲酸在生物體內(nèi)異構(gòu)酶的作用下以全反式維甲酸 (alltrans retinoic acid, ATRA)和順式維甲酸 (cis-retinoic acid, cis-RA)的形式存在[1,2]。研究表明，全反式維甲酸能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等細(xì)胞的分化以及骨代謝相關(guān)基因的表達(dá)，參與骨骼的發(fā)育與代謝[3]。當(dāng)其缺乏時(shí)，它會破壞成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡，引起骨質(zhì)增殖或骨質(zhì)不吸收，孕婦如果缺乏維甲酸會直接影響胎兒發(fā)育，甚至發(fā)生死胎[4]。然而在1953年，Cohlan[5]報(bào)道了孕鼠攝入過多維生素A導(dǎo)致胎鼠露腦等多種畸形。隨后的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，過量的維甲酸對脊椎動物以及胎兒有致畸作用[6～8]。已有研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的維甲酸對小鼠胎鼠的致畸效果不同[9,10]。然而關(guān)于不同孕期維甲酸誘導(dǎo)的胎鼠畸形的機(jī)理研究較少，且不同的學(xué)者對于維甲酸引起骨骼畸形的代謝機(jī)理觀點(diǎn)不盡一致，因此本文探究了不同劑量、不同孕期維甲酸對小鼠胚胎生長發(fā)育的影響，并試圖從基因?qū)用娉醪教骄烤S甲酸的致畸機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

ICR小鼠購于浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，經(jīng)飼養(yǎng)觀察3 d后用于實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)程序按本校實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)范(2013051201)執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

全反式維甲酸購于上海第六制藥廠，批號 01007；阿利新藍(lán)、茜素紅購于Amresco公司； RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購于Bio-Rad公司；橄欖油購于中糧集團(tuán)；甘油、丙酮等購于國藥集團(tuán)，分析純。

主要儀器：體式顯微鏡(Nikon，日本)；臺式高速低溫離心機(jī)(Sigma，德國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 方法

1.3.1維甲酸對胎鼠的致畸作用 ①不同劑量的維甲酸對胎鼠的致畸作用。取孕鼠16只，隨機(jī)分成4組，設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(ATRA-橄欖油懸液，灌胃)和1個(gè)溶劑對照組(橄欖油，灌胃)。實(shí)驗(yàn)組在小鼠妊娠11.5 d 分別灌胃10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的ATRA-橄欖油懸液。在懷孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并測定相關(guān)指標(biāo)。

②維甲酸對不同孕期的小鼠胚胎的致畸作用。取孕鼠16只，隨機(jī)分成4組，設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(ATRA-橄欖油懸液，灌胃)和1個(gè)溶劑對照組(橄欖油，灌胃)。實(shí)驗(yàn)組分別在小鼠懷孕的7.5 d、11.5 d 和 15.5 d 以50 mg/kg的劑量灌胃ATRA-橄欖油懸液。在懷孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2胎鼠骨骼染色 取胎鼠，95%酒精固定45 min，去除全身皮膚、皮下脂肪、內(nèi)臟，重新置于95%酒精中固定36 h。然后置于丙酮中脫脂36 h，將脫脂后的標(biāo)本分別置于0.017%茜素紅、0.025%阿利新藍(lán)中，37℃各染色1 d。將染色后的骨骼置于20%甘油中平衡1 h，再置于20%甘油與1% KOH混合的透明液中透明3 d。標(biāo)本保存于20%甘油中[11,12]，體式顯微鏡下觀察骨骼發(fā)育情況，測量骨骼長度。

1.3.3胎鼠的RNA提取與RT-PCR 按照試劑盒提取胎鼠總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH(上游引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′)為內(nèi)參基因，分析Cyp26b1(上游引物：5′-CTGGCTGCTACAGGGTTCTG-3′，下游引物：5′-CTCGCCCATGAGGATCTTGC-3′)基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢骨骼發(fā)育的影響

2.1.1不同劑量維甲酸對胎鼠四肢長骨發(fā)育的影響 由圖1可見，在懷孕第11.5 d灌胃不同劑量的維甲酸對小鼠體內(nèi)胎鼠的致畸作用主要表現(xiàn)在四肢骨骼上。胎鼠四肢長骨均普遍短于對照組，并且隨維甲酸劑量的升高不斷縮短(圖1A)，這說明維甲酸對小鼠四肢骨骼發(fā)育有抑制作用。并且維甲酸對胎鼠長骨的成骨部分抑制影響尤為劇烈，隨著維甲酸劑量的升高，四肢長骨的成骨部分縮短明顯(圖1A、B)。在維甲酸作用下，小鼠的橈骨、尺骨、股骨、脛骨、腓骨均表現(xiàn)出成骨骨化缺失(圖1B、C)，這表明維甲酸對胎鼠四肢骨骼發(fā)育的抑制作用主要影響骨骼的骨化過程。

2.1.2維甲酸對胎鼠四肢手(足)骨發(fā)育的影響

由圖2可見，在懷孕第11.5 d灌胃不同劑量的維甲酸，對小鼠四肢手(足)骨發(fā)育的統(tǒng)計(jì)，手指骨和足趾骨影響較大(圖2B)，伴隨著維甲酸作用劑量的上升，胎鼠指(趾)骨的分化逐漸減弱(圖2A)，當(dāng)灌胃量達(dá)到50 mg/kg以上時(shí)，出現(xiàn)少指(趾)、并趾、跗骨縮短甚至愈合的現(xiàn)象(圖2B)，這說明在孕期11.5 d，一定劑量的維甲酸可以干擾骨骼的分化。

圖1 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢長骨發(fā)育的影響Fig.1 The effects of different doses of ATRA on long bone of limbs in fetal rat.A.不同劑量維甲酸作用下小鼠整體骨骼、四肢骨骼染色圖(1為肱骨，2為橈骨和尺骨，3為股骨，4為脛骨和腓骨，紅色代表成骨，藍(lán)色代表軟骨)；B.不同劑量維甲酸作用下小鼠長骨(肱骨、橈骨、尺骨)的成骨長度；C.不同劑量維甲酸作用下小鼠長骨(股骨、脛骨、腓骨)的成骨長度。*與**表示，對照組相比在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

圖2 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢指(趾)骨發(fā)育的影響Fig.2 The effects of different doses of ATRA on bone of fingers and toes in fetal rat.A．畸形趾骨(1為少趾，2為并趾，3為跗骨縮短或愈合)；B. 不同灌胃劑量對胎鼠指(趾)數(shù)的影響；C. 不同灌胃劑量對胎鼠跗骨長的影響。**表示與對照組(0 mg/kg組)相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.2 維甲酸對不同孕期胎鼠骨骼發(fā)育的影響

由圖3可見，在小鼠的不同孕期，維甲酸對胎鼠的致畸程度不同。在孕7.5 d，維甲酸可引起胎鼠尾椎縮短變形或無尾椎、胸肋骨發(fā)育異常等現(xiàn)象(圖3B)；在孕11.5 d，維甲酸主要使胎鼠四肢骨骼發(fā)育遲緩，出現(xiàn)四肢長骨的成骨縮短或消失，并抑制指(趾)骨分化；在孕15.5 d，維甲酸對骨骼的致畸作用弱于7.5 d 和11.5 d，但也能在一定程度上使胎鼠四肢長度縮短，指(趾)個(gè)數(shù)減少，并且影響成骨的骨化。(圖3B～E)。

圖3 維甲酸對不同孕期小鼠骨骼發(fā)育的影響Fig.3 The effects of ATRA on bones in different pregnancy time of mice.A.小鼠整體骨骼染色圖；B.不同孕期維甲酸的致畸作用，1為胸肋骨異常，2為尾椎消失，3為橈骨、尺骨縮短，4為后肢發(fā)育異常，5為成骨骨化不完全；C、D、E.灌胃時(shí)間對胎鼠尾長、前后肢長、指(趾)數(shù)的影響。**表示與對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.3 維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)水平的影響

Cyp26屬于細(xì)胞色素P450超家族成員, 它能編碼特異代謝維甲酸的氧化酶，Cyp26家族有3 種亞家族成員, 即Cyp26a1、Cyp26b1和Cyp26c1[13]。研究表明，CYP26B1是骨骼發(fā)育的主要維甲酸代謝酶，它可以降解過量的維甲酸，從而抑制維甲酸的致畸作用[14,15]。而本研究通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在孕期11.5 d，給予10 mg/kg的維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)的影響不大，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，當(dāng)給予50 mg/kg和100 mg/kg維甲酸時(shí)，胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)下降，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖4A)。

當(dāng)控制維甲酸的給予劑量為50 mg/kg 時(shí)，不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)對維甲酸在Cyp26b1基因水平上的反應(yīng)也不相同，隨著孕期天數(shù)的增加，胎鼠體內(nèi)Cyp26b1基因表達(dá)水平上升，但Cyp26b1基因的相對表達(dá)量都低于對照組(P<0.01)，這說明一定劑量的維甲酸能夠抑制孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)內(nèi)胎鼠Cyp26b1基因的表達(dá)(圖4B)。

圖4 維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)水平的影響Fig.4 The effects ofCyp26b1gene expression levels on fetal rat.A.不同劑量維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)水平的影響；B.維甲酸對不同孕期胎鼠Cyp26b1基因表達(dá)水平的影響。**表示與對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

3 討論

維甲酸是維生素A 在體內(nèi)代謝的中間產(chǎn)物，過量的維甲酸對大鼠、倉鼠、雞等動物具有致畸性[16～18]。梁天琦[19]用50 mg/kg維甲酸誘導(dǎo)BALB/c小鼠，制作腭裂模型；夏敏杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)50 mg/kg維甲酸對SD 大鼠胚胎具有明顯的致畸作用；陳默等[9]研究發(fā)現(xiàn)80 mg/kg維甲酸是造成小鼠胚胎典型畸形的最佳灌胃劑量。本研究也發(fā)現(xiàn)10 mg/kg的維甲酸對胎鼠的四肢、指(趾)數(shù)影響較小(圖1)，當(dāng)維甲酸的劑量達(dá)到50 mg/kg和100 mg/kg時(shí)，小鼠胚胎四肢、指(趾)數(shù)出現(xiàn)畸形，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

對于不同孕期的小鼠，維甲酸的致畸效果也不同。當(dāng)孕期為7.5 d時(shí)，維甲酸主要導(dǎo)致尾椎骨、胸肋骨骨骼的畸變；當(dāng)孕期為11.5 d時(shí)，維甲酸則能使四肢骨骼發(fā)育遲緩、抑制指(趾)骨分化；當(dāng)孕期為15.5 d時(shí)，維甲酸對骨骼的致畸作用減弱，主要表現(xiàn)為干預(yù)成骨的骨化。這可能是由于在孕娠的不同時(shí)間，骨骼發(fā)育的次序不同，在7.5 d時(shí)主要是胎鼠椎骨和胸肋骨發(fā)育時(shí)期，此時(shí)維甲酸的過量攝入必然導(dǎo)致這些骨骼的發(fā)育異常；而當(dāng)11.5 d時(shí)胎鼠四肢骨發(fā)育活躍，過量的維甲酸會導(dǎo)致這些骨骼的畸變；當(dāng)15.5 d時(shí)胎鼠的骨骼基本發(fā)育完全，因而維甲酸對胎鼠的致畸作用減弱，但此時(shí)成骨的骨化還未結(jié)束，因而在這一時(shí)期維甲酸主要抑制成骨骨化。

CYP26B1細(xì)胞色素酶是體內(nèi)調(diào)節(jié)維甲酸水平的關(guān)鍵酶，它能夠分解代謝維甲酸，在對不同底物代謝效率的競爭性研究中發(fā)現(xiàn)，CYP26B1的首選作用底物是反式維甲酸[20]，CYP26B1細(xì)胞色素酶在體內(nèi)的表達(dá)量受Cyp26b1基因調(diào)控[21]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著維甲酸劑量的提高，Cyp26b1基因表達(dá)水平會下降，當(dāng)維甲酸給予劑量為50 mg/kg和100 mg/kg時(shí)，Cyp26b1基因表達(dá)量與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；同時(shí)50 mg/kg維甲酸也會引起不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)胎鼠體內(nèi)Cyp26b1基因表達(dá)水平下降(P<0.01)。Cyp26b1基因水平的降低是否引起CYP26B1蛋白酶表達(dá)量的下降，CYP26B1蛋白表達(dá)量改變后是否改變對維甲酸的降解，從而加深維甲酸的致畸作用，這些都有待于進(jìn)一步研究。

總之，維甲酸灌胃各組孕娠小鼠，胎鼠骨骼均有不同程度和不同頻率的變短、變小、畸形、缺失以及骨化延遲的現(xiàn)象出現(xiàn)，并且這種畸變隨著維甲酸的給予劑量和小鼠孕期天數(shù)的不同而不同，同時(shí)維甲酸能夠降低與維甲酸降解酶相關(guān)的Cyp26b1基因的表達(dá)水平。