隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響

鄧鳳春 于占江 楊鈺 趙紅曄 王濱 周麗

1.齊齊哈爾醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院普外科，黑龍江齊齊哈爾161001;3.齊齊哈爾醫(yī)學院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響

鄧鳳春1于占江2楊鈺2趙紅曄3王濱3周麗3

1.齊齊哈爾醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院普外科，黑龍江齊齊哈爾161001;3.齊齊哈爾醫(yī)學院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的通過測定隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的影響，探討其抗腫瘤的作用機制。方法采用四甲基偶氮哇藍(MTT)比色法檢測隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，采用Real Time RT-PCR檢測隱丹參酮對VEGF mRNA表達的影響。結(jié)果20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于人胃癌SGC-7901細胞6～48 h，其生長和增殖均受到一定程度的抑制;24 h為隱丹參酮對SGC-7901細胞抑制作用的最佳時間，IC50為59.11 μmol/L;選取40、60和80 μmol/L 3個劑量作用于人胃癌細胞SGC7901 24 h后，60和80 μmol/L的隱丹參酮均可下調(diào)VEGF mRNA的表達(均P＜0.01)。結(jié)論隱丹參酮可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，并能抑制VEGF mRNA的表達，提示這可能是其抗腫瘤的作用機制之一。

隱丹參酮;人胃癌SGC-7901細胞;四甲基偶氮唑藍;血管內(nèi)皮生長因子;實時熒光定量PCR

隱丹參酮(cryptotanshinone，CPT)是從活血化疲中藥丹參中提取出的有效成分，可以誘導腫瘤細胞分化和促進腫瘤細胞凋亡，能夠在一定程度上阻礙腫瘤細胞侵襲和防止其向遠處轉(zhuǎn)移，具有抗腫瘤細胞的活性，且抗瘤譜較廣，日益受到關(guān)注［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前最重要的血管生成刺激因子之一，在腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移中起著重要作用，可誘導體外內(nèi)皮細胞的增殖和遷移及體內(nèi)血管生成［2］。本研究檢測不同濃度的隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞增殖及VEGF mRNA表達的影響，探討隱丹參酮抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑

隱丹參酮購自上海源葉生物科技有限公司(HPLC≥98%);胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料研究所;RPMI 1640培養(yǎng)基及細胞消化液胰酶(Tyrisin)為美國Gibco公司產(chǎn)品;四甲基偶氮哇藍(MTT)、二甲基亞礬(DMSO)均為美國Sigma公司產(chǎn)品;VEGF和β-肌動蛋白(β-actin)引物由TAKARA公司合成; RNAiso Reagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

倒置顯微鏡(IMT-2)產(chǎn)自O(shè)lympus公司;超凈工作臺產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CO2孵箱產(chǎn)自Thermo Electron公司;-80℃超低溫冰箱產(chǎn)自日本SANYO公司;酶標儀產(chǎn)自美國Bio-rad公司;7300 Real Time PCR System產(chǎn)自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制試驗(MTT法)

隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲備液，過濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO的終濃度≤0.1%(V/V)。

取對數(shù)增長的SGC-7901細胞，以1×104個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定生長4 h后，設(shè)空白對照組和5個不同濃度的隱丹參酮組(終濃度為20、40、60、80、100 μmol/L)，每種濃度5個復(fù)孔。除空白對照組外，每孔中加入相應(yīng)濃度的隱丹參酮，分別刺激6、12、24、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;小心吸去培養(yǎng)液;每孔加入150 μL DMSO，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標儀570 nm/630 nm(主波長570 nm，參比波長630 nm)測量各孔的吸光值并計算抑制率。抑制率=(對照組OD值-用藥組OD值)/對照組OD值×100%。每組去掉一個OD值最低值和一個最高值，取剩余3個復(fù)孔OD值來計算。

1.2.2 熒光實時定量PCR

取對數(shù)增長的SGC-7901細胞，以1×104個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，待細胞穩(wěn)定生長4 h后，設(shè)空白對照組和3個不同濃度的隱丹參酮組(終濃度為40、60、80 μmol/L);于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h，收取各組細胞用Real Time RT-PCR方法檢測細胞的VEGF mRNA的表達。

1.2.2.1 抽提總RNA按RNAiso Reagent操作說明書提取各組細胞的總RNA，紫外分析及電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。

1.2.2.2 單鏈cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒，嚴格按說明書操作。各目的基因的引物序列［3］及產(chǎn)物大小如下:VEGF:Forward 5’-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3’，Reverse 5’-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3’，417 bp;β-actin:Forward 5’-CCATG TACGTTGCTATCCAGG-3’，Reverse 5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3’，252 bp。

1.2.2.3 Real Time PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒，應(yīng)用ABI 7300 Real Time PCR System采用兩步法PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，10 s(1個循環(huán)); PCR反應(yīng)95℃，5 s，60℃，31 s(40個循環(huán))。

1.2.2.4 產(chǎn)物分析使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程各檢測樣本的閡循環(huán)(Threshold cycle，CT)，閡循環(huán)值隨模板濃度增大而減少。每個樣本均設(shè)5個復(fù)孔，內(nèi)參照基因亦設(shè)5個復(fù)孔。采用2-△△CT的方法［4］分析VEGF mRNA表達水平

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞生長增殖的影響

以20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細胞6～48 h后，采用MTT法檢測細胞的增殖抑制情況。實驗表明，隱丹參酮能明顯抑制SGC 7901細胞的增殖，隨著藥物濃度及作用時間的增加，抑制作用也逐漸增強，尤以刺激24 h和48 h明顯，呈劑量與時間依賴性。由于刺激48 h后，最低濃度的隱丹參酮對SGC-7901細胞的抑制率已超過50%，故選取24 h作為隱丹參酮對SGC-7901細胞抑制作用的最佳時間。見表1。

刺激24 h后，隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關(guān)系(y=0.498x+20.56，R2=0.972)，并由此計算出隱丹參酮對SGC-7901細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為59.11 μmol/L，故選取40、60、80 μmol/L 3個劑量作為后續(xù)實驗中隱丹參酮的給藥濃度。

表1 不同濃度隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用(%，±s，n=3)

組別刺激6 h刺激1 2 h刺激2 4 h刺激4 8 h 2 0 μ m o l / L隱丹參酮組4 0 μ m o l / L隱丹參酮組6 0 μ m o l / L隱丹參酮組8 0 μ m o l / L隱丹參酮組1 0 0 μ m o l / L隱丹參酮組9 . 0 8 ± 1 . 2 0 9 . 5 2 ± 3 . 3 6 2 0 . 7 4 ± 0 . 3 0 1 9 . 8 6 ± 2 . 1 5 2 5 . 7 4 ± 0 . 9 6 1 2 . 9 3 ± 1 . 0 6 1 1 . 6 7 ± 1 . 0 4 2 0 . 8 3 ± 0 . 2 4 2 4 . 6 3 ± 1 . 4 8 3 0 . 9 3 ± 3 . 1 5 3 3 . 2 3 ± 4 . 7 2 3 9 . 3 2 ± 4 . 2 8 4 6 . 4 4 ± 7 . 0 3 6 1 . 3 0 ± 5 . 4 1 7 2 . 0 9 ± 5 . 3 1 5 1 . 6 8 ± 2 . 4 6 5 6 . 4 3 ± 2 . 9 4 5 8 . 7 6 ± 4 . 3 8 6 5 . 4 7 ± 3 . 3 8 7 4 . 8 4 ± 5 . 0 3

2.2 隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞VEGF mRNA表達的影響

以40、60、80 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細胞24 h后，通過2-ΔΔCT法計算各組SGC-7901細胞VEGF mRNA的表達水平，見表2。

由表2和圖1可見，與空白對照組相比，40 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達量雖有所減低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而60 μmol/L和80 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達量均較空白對照組明顯降低(均P＜0.01)，且有隨藥物濃度的增加而逐漸減少的趨勢，其量效曲線呈對數(shù)關(guān)系，y=-0.6854Ln(x)+3.3759，R2=0.9884。

表2 不同濃度隱丹參酮對人胃癌SGC-7901細胞血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響(±s，n=5)

注:與空白對照組比較，**P＜0.01;與40 μmol/L隱丹參酮組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;CT:閡循環(huán)

組別V E G F CT平均值β -a c t i n CT平均值V E G F m R N A表達量空白對照組4 0 μ m o l / L隱丹參酮組6 0 μ m o l / L隱丹參酮組8 0 μ m o l / L隱丹參酮組2 7 . 6 9 ± 0 . 2 7 2 8 . 0 5 ± 0 . 2 0 2 8 . 7 1 ± 0 . 1 6 2 9 . 2 1 ± 0 . 3 2 2 0 . 2 1 ± 0 . 1 5 2 0 . 3 2 ± 0 . 3 1 2 0 . 2 7 ± 0 . 3 2 2 0 . 3 6 ± 0 . 1 6 0 . 9 6 ± 0 . 2 4 0 . 8 6 ± 0 . 1 9 0 . 5 4 ± 0 . 1 6**#0 . 3 9 ± 0 . 0 7**##

3 討論

胃癌在全世界的發(fā)病率都很高，根治性切除術(shù)是目前唯一可以治愈胃癌的方法，但大部分患者術(shù)后會發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移［5］。因此，研究更有效的治療藥物以延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量一直是備受關(guān)注的熱點。

中藥以其天然、毒副作用小的優(yōu)勢為抗腫瘤研究提供了新的思路和方法。隱丹參酮是中藥丹參中具有很強代表性的脂溶性有效組分。大量研究證實，隱丹參酮具有廣譜的胞毒效應(yīng)，如黑色素瘤、膽管癌、白血病等［6-8］，故其在腫瘤治療方面具有較大的臨床藥用開發(fā)價值。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能明顯抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖，藥物作用顯示出顯著的劑量-時間-效應(yīng)依賴關(guān)系;且24 h為隱丹參酮對SGC-7901細胞抑制作用的最佳時間，IC50為59.11 μmol/L。

腫瘤血管的生成是腫瘤無限增殖和轉(zhuǎn)移的必要條件［9］，而腫瘤血管的生成是由一系列促血管生成因子而引發(fā)和維持的病理血管生成過程。VEGF是目前最重要的促血管生成因子之一，且在腫瘤組織中有較高表達［10-11］。抑制VEGF的表達不但可以抑制腫瘤的生長，還可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，故抗腫瘤血管生成可能成為治療腫瘤新的方法。卞維鵬等［12］研究表明，隱丹參酮是一種新的小分子血管生成抑制劑，由此推測隱丹參酮可能通過抑制血管生成起到一定的抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的隱丹參酮(40、60、80 μmol/L)作用于人胃癌SGC-7901細胞24 h后，經(jīng)Real Time RT-PCR法檢測后表明:VEGF mRNA表達下調(diào)，且隨藥物濃度的增加而逐漸減少。

綜上所述，隱丹參酮不僅能抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，還能通過抑制腫瘤細胞VEGF mRNA的表達而具有潛在的抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，但機制尚不十分清楚。隨著研究的不斷深入，將會更深層次地探究隱丹參酮抑制腫瘤細胞增殖及抗腫瘤血管生成的分子機制。

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Effect of cryptotanshinone on the proliferation and vascular endothelial growth factor mRNA expression in human gastric cancer cell line SGC-7901

DENG Fengchun1YU Zhanjiang2YANG Yu2ZHAO Hongye3WANG Bin3ZHOU Li31.Department of Anatomy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Department of General Surgery，The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161001，China；3.Department of Physiology，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To observe the effect of cryptotanshinone on cell proliferation and vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA expression in human gastric cancer cell line SGC-7901，and to explore its possible anti-tumor mechanism.Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells were cultured in vitro and treated with cryptotanshinone. The cell proliferation was examined by the method of MTT.The transcriptions of VEGF mRNA were demonstrated by real-time RT-PCR.Results The cryptotanshinone groups with 20，40，60，80，100 μmol/L five different concentrations had significant inhibitory effects on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in 6，12，24 h and 48 h after drug action.This effect increased with increasing drug concentration and action time.24 h was the best time of cryptotanshinone action，and IC50of 24 h was 59.11 μmol/L.In the following study，the effects of cryptotanshinon groups with 40，60，80 μmol/L three different concentrations on human gastric cancer SGC-7901 cells were observed，the results indicated that 60 and 80 μmol/L cryptotanshinon down-regulated the expression of VEGF mRNA(both P＜0.01).Conclusion Within a certain drug concentration，cryptotanshinone can inhibit the proliferation of SGC-7901 cells and plays a potential role in inhibiting angiogenesis by down-regulating the expression of VEGF mRNA.

Cryptotanshinon；Human gastric cancer cell line SGC-7901；MTT;VEGF；Real-time quantitative reverse transcription-PCR

R735.2，R285.5

A

1673-7210(2015)02(c)-0007-04

2014-11-24本文編輯:程銘)

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(編號1253-1830)。

鄧鳳春(1975.12-)，男，吉林長春人，碩士，主要從事中藥抗腫瘤及其轉(zhuǎn)移研究。