蘸花法在植物遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用研究進(jìn)展

齊雯雯　宮曉琳　王洋　吳瑩

摘要 植物遺傳轉(zhuǎn)化是基礎(chǔ)理論研究和農(nóng)作物性狀改良的必要手段。隨著蘸花法在十字花科植物中的成功應(yīng)用被越來越多的學(xué)者關(guān)注，并用于許多模式植物及農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化。蘸花法簡便、高效、穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)化后可直接獲得轉(zhuǎn)基因種子。該文介紹了蘸花法的原理，分析影響轉(zhuǎn)化效率的因素，并總結(jié)了目前已成功應(yīng)用蘸花法的研究情況及篩選轉(zhuǎn)基因后代的優(yōu)化方法。

關(guān)鍵詞 遺傳轉(zhuǎn)化；蘸花；轉(zhuǎn)化效率；篩選

中圖分類號 Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2014）24-0009-02

遺傳轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。早期的轉(zhuǎn)化技術(shù)如葉盤法、共培養(yǎng)法均涉及到植物組織培養(yǎng)和再生，體細(xì)胞易變異產(chǎn)生不利影響[1]。Feldmann于1987年首次提出原位滲透轉(zhuǎn)化法，用農(nóng)桿菌浸染剛萌發(fā)的擬南芥種子并篩選出轉(zhuǎn)化陽性植株，避免了組織培養(yǎng)[2]。隨后，Bechtold在原位滲透轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)上建立了真空滲透法（vacuum infiltration），用處于花期的植株取代種子，倒置于農(nóng)桿菌菌液，同時抽真空處理，轉(zhuǎn)基因效率明顯提高[3]。1998年，Clough和Bent在菌液中加入表面活性劑Silwet L-77，取消抽真空，建立了蘸花法（floral dip），其轉(zhuǎn)化效率與真空滲透法相近[4]。Chung等發(fā)現(xiàn)噴霧（floral spray）處理可代替浸蘸花器，在保障轉(zhuǎn)化效率的前提下擴(kuò)大了應(yīng)用范圍[5]。蘸花法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化后可直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，避免了體細(xì)胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)的過程及移栽成活率低等問題。該文介紹蘸花法原理，總結(jié)轉(zhuǎn)化效率影響因素的優(yōu)化方案及轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法，為應(yīng)用蘸花法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供重要的技術(shù)策略。

1 轉(zhuǎn)化機(jī)理

研究表明，T-DNA攜帶的目的基因是異源插入[3]。擬南芥自花授粉，異源插入可能發(fā)生于花發(fā)育后期。Desfeux等單獨(dú)浸染擬南芥的雄蕊和雌蕊，在雌蕊后代中檢測到轉(zhuǎn)化株，而雄蕊后代中未發(fā)現(xiàn)，表明雌蕊是轉(zhuǎn)化的受體[6]。農(nóng)桿菌浸漬處理后，GUS染色發(fā)現(xiàn)胚珠顯色，而花粉和花藥未顯色，說明轉(zhuǎn)化的有效部位為雌配子體，但不排除雄配子體存在小概率轉(zhuǎn)化[6]。擬南芥的子房室不總關(guān)閉，卵細(xì)胞發(fā)育突出，會延伸成瓶狀結(jié)構(gòu)并在頂部開口，花發(fā)育后期子房室頂部閉合。轉(zhuǎn)化一般在花芽形成前5～10 d進(jìn)行，此時雌蕊開放，農(nóng)桿菌進(jìn)入子房并將T-DNA轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞[7]。

2 影響蘸花法轉(zhuǎn)化效率的因素

蘸花法轉(zhuǎn)化效率受多重因素影響，且在不同物種間存在差異。近年來，關(guān)于蘸花法影響因素分析的報道增多，已在擬南芥[4-7]、甘藍(lán)型油菜[8-9]、苜蓿[10]等不同的物種中分析了農(nóng)桿菌、蔗糖、表面活性劑、浸染次數(shù)及間隔等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響（表1）。

2.1 植物發(fā)育時期

蘸花法需在長出花序的植株上進(jìn)行，多數(shù)植物以初花期為最佳轉(zhuǎn)化時期。擬南芥在主枝切除、次級分枝僅有少許花開放時轉(zhuǎn)化效率最高[4]；白菜的最適浸染時期為花薹抽出期[16]；甘藍(lán)型油菜花薹抽出時，摘除主薹1周后浸染最適[8]；蘿卜浸染的最適時期為初薹發(fā)育期[14]。

2.2 表面活性劑的種類及用量

表面活性劑有很強(qiáng)的吸附性和滲透能力，能減少液體的表面張力，利于農(nóng)桿菌的吸附。Clough等加入0.02%的Silwet L-77使轉(zhuǎn)化效率提高2倍[4]。Curtis等用含有3種不同表面活性劑的菌液轉(zhuǎn)化蘿卜，對比得出Silwet L-77轉(zhuǎn)化效率最佳，Pluronic F-68次之，Tween 20最低[14]。Mireault等用XIAMETER OFX-0309代替Silwet L-77，使轉(zhuǎn)化效率提高了3倍[19]。表面活性劑濃度過高對植株有明顯的傷害，可致植株枯萎，Silwet L-77的濃度建議為0.02%～0.05%，不應(yīng)超過0.1%。

2.3 蔗糖濃度

蔗糖能保持花粉內(nèi)外壓強(qiáng)一致，并為轉(zhuǎn)化提供能量，利于農(nóng)桿菌在受體表面生存。蔗糖還能誘導(dǎo)vir基因的表達(dá)，利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化[1]。蔗糖濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞失水，嚴(yán)重時細(xì)胞死亡。Clough等發(fā)現(xiàn)無蔗糖時蘸花法轉(zhuǎn)化效率極低，蔗糖濃度為10%時轉(zhuǎn)化效率最高，但結(jié)合轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，建議蔗糖濃度為5%[4]?？捎檬秤眉壵崽腔蚱咸烟谴嬖噭┘壵崽且怨?jié)約成本。

2.4 浸漬時間、次數(shù)

Chung等發(fā)現(xiàn)浸漬時間由5 s延長至5 min會使轉(zhuǎn)化效率提高2倍[5]，但浸漬時間過長會影響花序成活率。Clough等試驗(yàn)表明，3次浸漬比單次處理的轉(zhuǎn)化效率提高1倍[4]。多次浸漬處理的轉(zhuǎn)化效率較高，是由于農(nóng)桿菌在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化反復(fù)發(fā)生，其活性會隨時間的延長而下降，多次浸漬可增加活性農(nóng)桿菌的數(shù)目，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化效率。Clough等發(fā)現(xiàn)，2次浸漬的間隔少于4 d或超過2周均會給轉(zhuǎn)化植株造成不利影響[4]。因此，應(yīng)結(jié)合植株的生長狀態(tài)來確定最佳的浸漬時間、次數(shù)及間隔。

2.5 其他因素

Miguel等把農(nóng)桿菌的OD600從0.8提高到2.0，其轉(zhuǎn)化效率從2%提高到3%，說明適度提高農(nóng)桿菌的細(xì)胞密度可提高轉(zhuǎn)化效率[11]。農(nóng)桿菌菌株的類型對轉(zhuǎn)化效率有影響[20]，試驗(yàn)表明，農(nóng)桿菌GV3101的轉(zhuǎn)化效率高于LBA4404[13]。浸漬試驗(yàn)多選擇在溫度較低的時段進(jìn)行，利于T-DNA整合入植物細(xì)胞。接種后用塑料膜覆蓋保濕，利于菌液和植物充分接觸，時間控制在12～24 h。接種方式有多種，針對不方便倒置浸漬的植物，可用微量進(jìn)樣器將滲透緩沖液逐滴加到花序[15]，或用注射器將緩沖液注入花苞[18]；需大批量轉(zhuǎn)化可用噴霧法[21]，但滲透緩沖液對身體有害，需注意安全防護(hù)；而轉(zhuǎn)化效率較低的物種，可在蘸花時用抽真空輔助[4]。

3 蘸花法轉(zhuǎn)化后代的篩選與鑒定

蘸花法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化，外源DNA可整合入受體細(xì)胞?？筛鶕?jù)浸漬時菌株質(zhì)粒所攜帶的標(biāo)記基因確定篩選方案，通過觀察植株?duì)顟B(tài)確定轉(zhuǎn)化株；也可PCR鑒定標(biāo)記基因或GUS染色，確定轉(zhuǎn)化株及轉(zhuǎn)化效率。Clough等將轉(zhuǎn)化后的T0代擬南芥種子消毒并播種到含有適量卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選，并提取轉(zhuǎn)化株的基因組DNA進(jìn)行雜交檢測確定轉(zhuǎn)化效率[4]。Cao等用草丁膦篩選小白菜轉(zhuǎn)化后代，并PCR鑒定C58質(zhì)粒上的virG 基因確定轉(zhuǎn)化株[22]。為減少篩選時間以提高效率，Harrison等調(diào)整培養(yǎng)光照時間，將篩選時間由7～10 d縮短為3.25 d[23]。Davis等用色譜沙篩選轉(zhuǎn)化后代，無需對種子消毒，節(jié)省了時間和成本且避免污染[24]。

4 蘸花法的應(yīng)用與展望

近年來，蘸花法轉(zhuǎn)化的相關(guān)報道逐漸增多。隨著蘸花法的改進(jìn)，已在基因工程等領(lǐng)域廣泛運(yùn)用，如T-DNA轉(zhuǎn)移及整合、基因的功能分析、突變體庫的構(gòu)建等[25-26]。該方法在多個物種中成功應(yīng)用，其中除了蘿卜[14]、鹽芥[17]等十字花科植物，還包括重要的農(nóng)作物如小麥[12]和經(jīng)濟(jì)作物如豆科植物[10，13]等。由于技術(shù)方法的限制，蘸花法仍有不足，如目前沒有通用的組合方案，轉(zhuǎn)基因后代需自交篩選獲得純合體等。因此，進(jìn)一步完善蘸花法技術(shù)體系可為植物轉(zhuǎn)基因研究提供更多便利，為提高農(nóng)作物抗逆性、抗蟲害、抗病性等提供有效途徑。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 韋獻(xiàn)雅，付紹紅，牛應(yīng)澤.農(nóng)桿菌介導(dǎo)floral-dip轉(zhuǎn)基因方法研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報，2006，28（3）：362-367.

[2] FELDMANN K A，MARKS M D.Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana：A non-tissue culture approach[J].Molecular and General Genetics，1987，208（1-2）：1-9.

[3] BECHTOLD N，ELLIS J，PELLETIER G.In planta Agrobacterium-medi-ated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants[J].Life Sciences，1993（316）：1194-1199.

[4] CLOUGH S J，BENT A F.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[5] CHUNG M H，CHEN M K，PAN S M.Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants[J].Transgenic Research，2000（9）：471-476.

[6] DESFEUX C，CLOUGH S J，BENT A F.Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method[J].Plant Physiology，2000，123（3）：895-904.

[7] SMAGUR A W，KONKA K H，KONONOWICZ A K.Flower bud dipping or vacuum infiltration-two methods of Arabidopsis thaliana transformation[J].Russian Journal of Plant Physiology，2009，56（4）：560-568.

[8] WANG W C，MENON G，HANSEN G.Development of a novel Agrobact-erium-mediated transformation method to recover transgenic Brassica napus plants[J].Plant Cell Reports，2003，22（4）：274-281.

[9] LI J，TAN X L，ZHU F G，et al.A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets[J].International Journal of Biology，2010，2（1）：127-131.

[10] TRIEU A T，BURLEIGH S H，KARDAILSKY I V，et al.Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium[J].The Plant Journal，2000，22（6）：531-541.

[11] TRUJILLO M M，BRIONES V L，PONCE J L C，et al.Improving trans-formation efficiency of Arabidopsis thaliana by modifying the floral dip method[J].Plant Molecular Biology Reporter，2004，22（1）：63-70.

[12] ZALE J M，AGARWAL S，LOAR S，et al.Evidence for stable transform-ation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports，2009，28（6）：903-913.

[13] 王翠艷，丁東風(fēng)，于曉菊，等.Floral dip法在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究[J].南開大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，43（1）：34-38.

[14] CURTIS I S，NAM H G.Transgenic radish（Raphanus sativus L. longipi-nnatus Bailey）by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency[J].Transgenic Res-earch，2001，10（4）：363-371.

[15] 代法國，胡宗利，陳國平，等.一種獲得轉(zhuǎn)基因芥菜的簡便方法[J].生命科學(xué)研究，2011，15（1）：19-23.

[16] GAO Y，REN X L，RUAN S L，et al.Genetic transformation of Chinese cabbage（Brassica rapa pekinensis）with floral-dip method[J].Agricultural Biotechnology，2012，1（4）：22-24，27.

[17] BRESSAN R A，ZHANG C Q，ZHANG H，et al.Learning from the Ara-bidopsis experience.The next gene search paradigm[J].Plant Physiology，2001，127（4）：1354-1360.

[18] 陳彥，孫寬瑩，張濤.通過改良農(nóng)桿菌介導(dǎo)的floral-dip法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化紫薇[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2012，38（3）：250-255.

[19] MIREAULT C，PARIS L E，GERMAIN H.Enhancement of the Arabidopsis floral dip method with XIAMETER OFX-0309 as alternative to Silwet L-77 surfactant[J].Botany，2014（92）：1-3.

[20] GHEDIRA R，BUCK S D，NOLF J，et al.The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2013，26（7）：823-832.

[21] 張森.噴霧：一種簡便的擬南芥轉(zhuǎn)化方法[J].生物技術(shù)，2006，16（5）：36-38.

[22] CAO M Q，LIU F，YAO L，et al.Transformation of pakchoi（Brassica rapa L. ssp.chinensis）by Agrobacterium infiltration[J].Molecular Breeding，2000，6（1）：67-72.

[23] HARRISON S J，MOTT E K，PARSLEY K，et al.A rapid and robust method of identifying transformed Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip transformation. Plant Methods，2006，2（1）：19-27.

[24] DAVIS A M，HALL A，MILLAR A J，et al.Protocol：streamlined sub-protocols for floral-dip transformation and selection of transformants in Arabidopsis thaliana[J].Plant Methods，2009，5（1）：3-7.

[25] GALAU S J，BELLEC Y，F(xiàn)AURE J D，et al.Evaluation of the potential for interspecific hybridization between Camelina sativa and related wild Brassicaceae in anticipation of field trials of GM camelina[J].Transgenic Research，2014，23（1）：67-74.

[26] CHRISTIAN M，QI Y P，ZHANG Y，et al.Targeted mutagenesis of Arabidopsis thaliana using engineered TAL effector nucleases[J].G3：Genes | Genomes | Genetics，2013（3）：1697-1705.