茄子遺傳轉(zhuǎn)化植株再生體系的優(yōu)化

張明華等

摘 要：以4個(gè)茄子品種的下胚軸和子葉為外植體，通過不同外源激素種類和濃度組合篩選，對(duì)茄子遺傳轉(zhuǎn)化過程中外植體脫分化誘導(dǎo)、植株再生及生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，探索建立較為通用完善的茄子遺傳轉(zhuǎn)化植株再生體系。結(jié)果表明，茄子下胚軸的再生能力要顯著高于子葉，不同茄子品種間的分化能力差異明顯；最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，最佳植株再生分化培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。

關(guān)鍵詞：茄子；下胚軸；子葉；植株再生；遺傳轉(zhuǎn)化

茄子（Solanum melongena L.）是世界各地廣泛栽培的重要蔬菜之一，營養(yǎng)價(jià)值豐富，為加快育種進(jìn)程，國內(nèi)外已先后從茄子的器官分化[1，2]、花藥培養(yǎng)[3]、胚狀體誘導(dǎo)[4～6]、原生質(zhì)體培養(yǎng)[7]、小孢子培養(yǎng)[8，9] 子葉與下胚軸離體再生[10～12]等多方面進(jìn)行了研究。近30 a來，國內(nèi)的茄子組織培養(yǎng)研究工作取得了很大進(jìn)展，但是和同科同屬的番茄[13]、馬鈴薯[14]相比，仍有一定距離。茄子再生體系研究面臨的一個(gè)主要難題就是不定芽分化頻率較低，缺少通用穩(wěn)定的適于茄子遺傳轉(zhuǎn)化的植株再生體系。因此探索高效的受體再生途徑，建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系是目前的主要任務(wù)。本試驗(yàn)在課題組已有茄子離體培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上[15]，探討了不同外植體、激素配比、基因型等因素對(duì)茄子離體培養(yǎng)植株再生的影響。通過對(duì)植株再生體系的優(yōu)化，以期得到普遍適用的茄子離體培養(yǎng)再生體系，提高茄子遺傳轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)基因工程在茄子改良育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茄子品種為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的高代自交系長茄03154、03204，圓茄07683、07675。以種子露白后苗齡10 d的茄子下胚軸、子葉作為外植體。

1.2 無菌苗培養(yǎng)及外植體接種

將茄子種子用75%酒精浸泡30 s，后用無菌水沖洗1次，再用10% NaClO溶液浸泡20 min后用無菌水沖洗3次。接種至附加0.7%瓊脂和2%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上，置于（25±1）°C、光照時(shí)間為16 h/d、光強(qiáng)2 000～3 000 Lx光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。種子露白后苗齡10 d的無菌苗2片子葉可完全展開時(shí)從瓶中取出無菌苗，無菌條件下，將下胚軸切成0.8～1.0 cm小段、子葉切成（3～5）mm×5 mm小塊。將子葉正面向上放置，下胚軸橫向放置，接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，相同光照培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。每個(gè)品種、每種處理接種3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種8～10個(gè)外植體，重復(fù)3次。2周繼代1次，4周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

①誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置ZT、6-BA、IAA 3種激素不同種類及不同濃度組合，共12個(gè)組合處理，詳見表1。

②植株再生培養(yǎng)基優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基，外源激素ZT設(shè)0.2、0.5、0.8 mg/L 3個(gè)濃度處理。

③再生植株生根培養(yǎng)基優(yōu)化 以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，外源激素NAA設(shè)0.10、0.30、0.5 mg/L 3個(gè)濃度處理。

所有處理培養(yǎng)基均附加有機(jī)成分Morel維生素1 000倍液2 mL/L、蔗糖3%、瓊脂8.0%，pH值5.8，121℃溫度下高壓滅菌15 min。

1.4 不定芽生長和生根統(tǒng)計(jì)

待愈傷組織生長出不定芽后，轉(zhuǎn)移至植株再生培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5個(gè)三角瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)不定芽生長情況。當(dāng)不定芽長出2～4片真葉、長2～3 cm時(shí)，將其自基部切下并轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種10個(gè)三角瓶，每瓶接種2個(gè)再生苗，重復(fù)3次，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

由表2可知，不同配比的12種培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)品種的子葉和下胚軸均能誘導(dǎo)出不定芽，但其誘導(dǎo)率存在顯著差異。在不使用6-BA的培養(yǎng)基M1～

M6中，ZT 2.0 mg/L+IAA

0.2 mg/L組合的M4培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的效果最好。為了研究比較6-BA與ZT對(duì)外植體不定芽誘導(dǎo)分化的效果，生長素IAA取最佳濃度0.2 mg/L，分裂素ZT、6-BA取不同濃度進(jìn)行比較。當(dāng)只加入6-BA時(shí)，M9培養(yǎng)基下胚軸的平均誘導(dǎo)率高于M7和M8培養(yǎng)基；當(dāng)ZT和

6-BA組合加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，M10培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好，且誘導(dǎo)率明顯高于M4和M9。

由DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可知，不同激素濃度組合的培養(yǎng)基顯著地影響了茄子不定芽的誘導(dǎo)率，4個(gè)品種之間表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律（圖1）。2.0 mg/L ZT 和3.0 mg/L 6-BA均能較好地誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，0.2 mg/L的IAA可以最佳地促進(jìn)分裂素ZT和6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)分化。6-BA、ZT對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化效果與茄子外植體類型和基因型都相關(guān)。對(duì)于不同外植體，ZT對(duì)子葉的誘導(dǎo)效果高于6-BA，最佳濃度為2.0 mg/L；6-BA對(duì)下胚軸的誘導(dǎo)效果較好，最佳濃度為3.0 mg/L。對(duì)于不同基因型，不定芽誘導(dǎo)的最適分裂素不同，6-BA對(duì)圓茄07675和長茄03204的誘導(dǎo)效果高于ZT，ZT對(duì)07683和03154誘導(dǎo)效果較好。IAA濃度為 0.2 mg/L，ZT 1.0～2.0 mg/L+6-BA 1.0～2.0 mg/L組合使用時(shí)對(duì)4個(gè)品種的不定芽誘導(dǎo)效果均較好，據(jù)此推測(cè)，該水平下的ZT+6-BA+IAA組合可以比較廣泛地適用于不同茄子品種的不定芽誘導(dǎo)分化。

2.2 外植體取材部位對(duì)植株再生的影響

橫向放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的下胚軸，培養(yǎng)1周后形態(tài)學(xué)頂端向上翹起，2周后開始有叢生芽在翹起的頂端形成，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接形成微型的小簇叢生芽結(jié)構(gòu)，同時(shí)接觸到培養(yǎng)基的下胚軸形態(tài)學(xué)下端形成愈傷組織（圖2A）。在下胚軸形態(tài)學(xué)頂端沒有形成叢生芽或叢生芽生長緩慢的情況下，下端愈傷組織也可分化產(chǎn)生不定芽。平鋪在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的子葉，1周后體積明顯膨大，傷口處開始產(chǎn)生愈傷組織，2周左右生長出不定芽生長點(diǎn)（圖2B）。