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    基質金屬蛋白酶—1基因啟動子區(qū)(—1607)基因多態(tài)性與腎移植后環(huán)孢素誘導牙齦增生的相關性

    2014-11-14 15:11:12戴巧群單海琴任雨吳寅孫科家葉小磊
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2014年30期
    關鍵詞:基質金屬蛋白酶基因多態(tài)性

    戴巧群+單海琴+任雨+吳寅+孫科家+葉小磊

    [摘要] 目的 研究MMP1基因單核苷酸多態(tài)(-1607)1G/2G與環(huán)孢素誘導牙齦增生(CsA-GO)發(fā)生風險的關系。 方法 以聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法,分別檢測42例環(huán)孢素誘導牙齦增生病人和118位正常對照者MMP1(-1607)1G/2G多態(tài)的基因型;以Logistic回歸模型計算不同基因型與環(huán)孢素誘導牙齦增生風險的關系。 結果 環(huán)孢素誘導牙齦增生病例組的MMP1(-1607)3種基因型頻率分布與對照組無顯著差異(P=0.37)。攜帶MMP1(-1607)2G基因型者發(fā)生環(huán)孢素誘導牙齦增生的風險比攜帶1G基因型者高1.38倍(95%CI=0.81~2.36,P=0.24),而1G基因型與環(huán)孢素誘導牙齦增生風險無關。 結論 MMP1基因啟動子區(qū)(-1607)1G/2G單核苷酸多態(tài)性可能并非環(huán)孢素誘導牙齦增生的遺傳易感因素,攜帶2G基因型的患者發(fā)生CsA-GO的風險有增高趨勢。

    [關鍵詞] 牙齦增生;基質金屬蛋白酶;基因多態(tài)性;遺傳易感性

    [中圖分類號] R781.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2014)30-0152-04

    環(huán)孢菌素(Cyclosporine,CsA)作為臨床常見的免疫抑制劑,主要應用于器官移植后的抗宿主排異反應,在臨床應用過程中可誘發(fā)藥物性牙齦增生(drug-induced gingival overgrowth,DGO),由CsA誘導的牙齦增生(CsA-GO)在腎移植后患者中發(fā)病率可以高達30%~50%。牙齦增生后不僅可以影響患者口腔的咀嚼以及美觀,而且為口腔微生物的生長提供了較佳的環(huán)境,可以增加免疫功能抑制患者系統(tǒng)感染的風險,導致嚴重并發(fā)癥的發(fā)生[1]。對使用CsA患者進行牙齦增生易感性研究,可以減少易感患者發(fā)生牙齦增生的可能性,為免疫抑制劑的使用提供指導。

    正常牙齦由上皮層和固有層構成,前者屬于上皮組織,附著于牙釉質或牙骨質的表面,后者主要為結締組織,包括細胞和細胞外基質兩部分,胞外基質中含有大量的膠原纖維,約占細胞外基質的60%。牙齦組織中的膠原I主要來源于牙齦成纖維細胞,基質金屬蛋白酶-1是負責I型膠原降解的主要蛋白水解酶,正常情況下,膠原I合成和降解處于平衡狀態(tài)。以往不少研究認為,CsA-GO發(fā)生可能與牙齦組織膠原代謝失衡有關,即合成-降解失衡[2]。有研究發(fā)現(xiàn),在環(huán)孢素作用下基質金屬蛋白酶-1(MMP1)活性下調,牙齦結締組織I型膠原降解受抑制,產生的膠原因無法降解而堆積[3,4]。對MMP1基因活性調節(jié)位點的研究顯示,在該基因啟動子區(qū)域上游1607位點1G/2G的多態(tài)性可以直接影響MMP-1的轉錄活性和蛋白表達水平[5],并與多種疾病的易感性存在相關性,如結直腸癌[6]、子宮內膜異位癥[7]等。而在口腔領域,Santos等發(fā)現(xiàn)種植體失敗患者2G型的比例明顯高于對照組[8,9]。國內外不少研究發(fā)現(xiàn)[10,11],該位點多態(tài)性與口腔鱗癌的易感性密切相關。以上研究說明,MMP1的活性影響到I型膠原代謝。目前,國內外尚未有關于MMP1多態(tài)性與環(huán)孢素誘導的牙齦增生的研究報道,因此,本研究著重探討MMP1上游啟動子區(qū)域-1607位點多態(tài)性與環(huán)孢素誘導的牙齦增生的相關性。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    選取我院2011年1月~2013年12月期間服用CsA達到6個月以上的腎移植患者160例,其中男125例,女35例,年齡18~60歲,術后最長時間6年,近3個月來未經任何牙周治療,根據是否存在牙齦增生分為牙齦增生組42例和未誘發(fā)牙齦增生組(對照組)118例,牙齦增生程度評估在Angelopoulos和Goaz等人方法基礎上有所調整,即0=無牙齦增生,1分=輕度牙齦增生;牙齦邊緣增厚,齦袋內有小葉狀顆粒增生,增生的牙齦覆蓋少于1/3牙冠;2分=中度牙齦增生;增生牙齦覆蓋至牙冠中部;3分=重度牙齦增生;2/3以上牙冠被增生牙齦覆蓋或全附著齦均有增生[12]。評估研究對象發(fā)現(xiàn),在牙齦增生組中為(1.96±0.61),在對照組中為(0.02±0.01),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血液中環(huán)孢素濃度在增生組中為(333.0±111.8)μg/mL,對照組中為(288.8±80.1)μg/mL,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    1.2 DNA提取

    抽取患者前臂靜脈血2 mL,以枸櫞酸鈉抗凝,采用北京天根TIANamp 血液基因組DNA提取試劑盒(DP318),提取外周血中白細胞DNA,方法參考試劑盒說明書。

    1.3 基因多態(tài)性檢測

    MMP1基因分型:采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對MMP1基因上游-1607區(qū)域進行擴增。MMP1(-1607)1G/2G引物設計以及方法按文獻報道進行[9]。擴增含該多態(tài)位點的PCR引物序列為上游引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAG -3′和下游引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAGTCTT -3′。PCR反應體系設置如下。北京百泰克2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL(含相關的PCR Buffer以及Taq聚合酶),上下游引物各0.2 μL,DNA模板1 μL,其余用水補齊反應體積到25 μL;PCR條件為:95℃變性2 min,然后94℃30 s,53℃30 s,72℃50 s進行30個循環(huán)后,72℃延伸6 min。由于在上游引物21位中引入錯配堿基CC,因此產物能用于BslI的酶切,大小為130bp。取15μL PCR產物與限制性核酸內切酶BslI(New England BioLabs)于37℃孵育3 h。酶切產物于3.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。經過酶切后,1G/1G基因型產生的片段大小為130bp;2G/2G產生27bp和103bp;雜合子則產生大小分別為130bp、103bp和27bp 的3個片段。每一批PCR反應均以蒸餾水替代DNA模板作為陰性對照,并設置雜合子患者為內對照,用于判斷每次酶切反應是否徹底,并隨機抽取10%的DNA標本對PCR產物進行測序分析以判斷方法的正確性。endprint

    1.4數(shù)據及統(tǒng)計分析

    得到患者以及對照組不同分型基因頻率后,分析是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。同時采用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據分析,用χ2檢驗比較各基因型頻率在病例組與對照組之間的差異。用比值比(oddsratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)表示攜帶某個基因型發(fā)生環(huán)孢素誘導牙齦增生的風險度。OR值以非條件Logistic回歸計算,并經性別、年齡狀況校正。

    2 結果

    見表1。在42個牙齦增生組中,MMP1(-1607)1G/1G、1G/2G和2G/2G這3種基因型的分布頻率分別為9.5%、40.5%和50.0%,在118個正常對照中,1G/1G、1G/2G和2G/2G的分布頻率分別為16.1%、41.5%和42.4%, 2個不同分組基因頻率分布經Hardy-Weinberg平衡定律(H-W test)檢測,顯示均符合H-W 分布(P>0.05)。Pearson卡方檢驗表明,這三種基因型在牙齦增生和對照組中差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.99,P=0.37)。Logistic回歸分析結果表明,以MMP1(-1607)1G/1G基因型攜帶者為參照,攜帶2G基因型者罹患牙齦增生患者的OR風險為攜帶1G基因的1.38倍(95%CI 0.81~2.36),因此,攜帶2G基因的患者發(fā)生CsA-GO的風險增加,但由于CI下限為0.81并未超過1,還不足以認為2G為易感的風險因素。

    3 討論

    CsA-GO的發(fā)生常與牙齦下結締組織中胞外基質的堆積有關,其構成以I型膠原為主,另外也存在3型膠原以及蛋白多糖等的積聚。牙齦組織中的膠原降解主要通過基質金屬蛋白酶-1和-3實現(xiàn)?;|金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組鋅離子或鈣離子依賴酶,以無活性的酶原形式分泌后可通過纖溶酶、胰蛋白酶或其他因子刺激后,剪接活化并降解1種或者多種細胞外基質成分,在細胞外基質代謝調節(jié)中起重要作用。CsA-GO的發(fā)生常與膠原代謝紊亂相關,其中MMPs活性以及表達受到較多研究的關注。Rutter等[13]在MMP1基因啟動子區(qū)上游1607位發(fā)現(xiàn)一個插入/缺失多態(tài)性,多出鳥嘌呤,使得位點區(qū)域序列變?yōu)?'-GGA-3',該型就是2G型,而只有1個鳥嘌呤的為1G型。該位點SNP普遍存在,正常個體中3種基因型比例分別為1G/1G 30%、1G/2G 30%、2G/2G 3%~40%,在癌細胞中2G/2G型的比例可提高到63.5%,與較強的基質降解并促進癌細胞轉移密切相關。其中2G等位基因形成一個轉錄因子ETS的核心結合序列,研究顯示ETS-1可以提高MMP-1啟動子活性達到10倍[14],同時也發(fā)現(xiàn)ETS可以通過動態(tài)調節(jié)MMP1和TIMP1酶系統(tǒng)的平衡而影響膠原的沉積,進而參與到化療藥物誘導的腎病ECM的重塑過程[15,16]。另一方面,1G等位基因則使得MMP1轉錄顯著降低。

    由于MMP1基因啟動子多態(tài)性使得MMP1的表達在不同人中存在較大的差異,因此不同的人對CsA所誘導的牙齦增生也存在易感性的差異。而且CsA可以抑制來自牙齦成纖維細胞中MMP-1的活性,且呈現(xiàn)濃度依賴性[3]。因此,CsA可以使得MMP1的表達和活性在不同人中存在一定程度的下降,進而引起膠原無法被有效降解,引起堆積增加。本研究顯示,牙齦增生以及未增生組中MMP1上游(-1607)基因多態(tài)性基因之間的分布無顯著差異,提示我們這一位點的多態(tài)性可能和CsA-GO發(fā)病無顯著關系,進一步的Logistic回歸分析顯示,攜帶1G基因型的患者發(fā)生CsA-GO的風險為攜帶2G基因型患者的0.73倍,95%CI為0.42~1.24,因此說明該位點并非發(fā)生CsA-GO的危險因素。

    MMP1啟動子多態(tài)性與口腔疾病的報道主要集中于與牙周炎發(fā)展的相關性,但是研究結果存在爭議,部分研究認為,含有2G/2G的患者發(fā)展為重度慢性牙周炎的風險遠高于1G等位基因的患者。也有一些研究顯示MMP1啟動子區(qū)域-1607位點多態(tài)性并非慢性牙周炎的風險因素,在不同分組中不存在統(tǒng)計學差異[17]。這些結果提示由于不同研究的種族差異、實驗樣本容量的差異以及試驗方法的不同,使得SNP與口腔疾病如牙周炎發(fā)展中的作用研究還處于探討階段。由于牙齦膠原代謝還和MMP家族中MMP3的活性有關,而MMP3和MMP1都定位于11q22.3上,兩者的分布頻率和連鎖不平衡性可能也影響到口腔疾病的易感性。

    總之,本研究首次在CsA-GO患者中探討了MMP1基因啟動子區(qū)域位點多態(tài)性與疾病發(fā)展的相關性。根據現(xiàn)有樣本結果分析顯示,MMP1基因啟動子區(qū)的功能性單核苷酸多態(tài)(-1607) 1G/2G與環(huán)孢素誘導牙齦增生的發(fā)生無顯著相關,但是攜帶2G等位基因的患者發(fā)生CsA-GO的風險增加。由于本研究的樣本量相對較小,還需要進一步擴大研究對象,并且收集更多的臨床預后資料,以探討該基因其他位點多態(tài)性以及相關基因如MMP3多態(tài)性對環(huán)孢素誘導牙齦增生易感性的相關性。

    [參考文獻]

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    (收稿日期:2014-05-21)endprint

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