金雀異黃素對膠原誘導關節(jié)炎大鼠發(fā)病的預防作用

柳桂萍++++++張育++++++王雯雯++++++劉家歡++++++許金鑫

[摘要] 目的 研究金雀異黃素（Gen）對Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎（CIA）大鼠發(fā)病的預防作用。 方法 24只大鼠隨機分為三組：空白對照組、模型對照組及Gen預防用藥組，每組8只。在造模前，預先給予Gen預防用藥組大鼠胃內灌注Gen 1周，使用Ⅱ型膠原建立模型對照組及Gen預防用藥組的CIA模型。觀察關節(jié)炎指數(shù)（AI）評分及關節(jié)腫脹度；通過免疫組化檢測微血管密度（MVD），評估關節(jié)滑膜的血管新生情況；應用免疫印跡法檢測炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α）和血管新生相關調節(jié)因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表達。 結果 CIA大鼠造模成功。與模型對照組比較，Gen預防用藥組大鼠炎性反應較輕，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與模型對照組相比，Gen預防用藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表達明顯降低（P < 0.05）。與模型對照組相比，Gen預防用藥組大鼠血清中VEGF表達降低，關節(jié)滑膜新生血管的形成減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。預防性使用Gen能夠降低CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 Gen能夠通過調節(jié)CIA大鼠體內炎性細胞因子，抑制血管新生相關調節(jié)因子的表達，阻止軟骨及骨的進一步破壞，對風濕性關節(jié)炎發(fā)病起到一定的預防作用。

[關鍵詞] 金雀異黃素；滑膜微血管密度；基質金屬蛋白酶

[中圖分類號] R593.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the prevention effects of Genistein （Gen） in collagen Ⅱ induced arthritis （CIA） rats. Methods 24 rats were randomly divided into three groups and each group contained 8 rats： blank control group， model control group and Gen prevention group. Before establishing the CIA rat model， the rats in Gen prevention group were given Gen by gavage for one week. The rats in model control group and Gen prevention group were given collagen Ⅱ to induce CIA model. Arthritis index scores and swell arthrosis were observed in CIA rats. Immunohistochemistry assay was used to examine microvascular density （MVD）， for further evaluation of angiogenesis in the synovial membrane of the joint. Western blot was used to detect the expression of inflammatory factors （IL-1β， TNF-α） and angiogenesis related regulatory factors （VEGF， MMP-1，MMP-2， MMP-9）. Results The CIA model was successfully constructed. In Gen prevention group， the inflammatory reaction of rats was lighter than model control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expressions of IL-1β and TNF-α in serum of Gen prevention group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expression of VEGF in serum and the number of new blood vessels in synovium of Gen prevention group were decreased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with model control group， taken Gen as a prevention could reduce the expression of MMP-1， MMP-2， MMP-9 in serum of CIA rats， and had statistical differences （P < 0.05）. Conclusion Gen plays a certain preventative role in developing of rheumatoid arthritis. The mechanism may function by regulating the inflammatory factors， inhibiting the expression of angiogenesis related regulatory factors and restricting the further destruction of cartilage and bone.

[Key words] Genistein； Microvessel density； Matrix metalloproteinase

風濕性關節(jié)炎（RA）的主要病理特點是在炎性環(huán)境中受各種炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和血管內皮生長因子（VEGF）的刺激，關節(jié)成纖維樣滑膜細胞（FLS）顯著增殖和微血管新生[1-2]，并進一步產(chǎn)生基質金屬蛋白酶（MMPs）、蛋白溶解酶類及前列腺素等物質，破壞關節(jié)軟骨及骨結構，從而導致關節(jié)畸形及功能障礙[3]。如能在發(fā)病早期及時進行有效的干預，則對RA的病情控制具有重要意義。筆者前期工作發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素（Gen）能夠調節(jié)RA成纖維樣滑膜細胞凋亡蛋白的表達，抑制其增殖，并能降低Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎（CIA）大鼠成纖維樣滑膜細胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子[4-6]。本研究應用體內實驗進一步觀察Gen對CIA大鼠發(fā)病的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供的雌性SD大鼠（清潔級），4周齡，體重為（120±20）g，動物許可證號：SCXK（蘇）2007-0001。

1.2 實驗材料

雞Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Gen純品（純度≥99%）購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；IL-1、TNF-α、VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購于美國CST公司；其余試劑均為進口分裝或市售分析純。

1.3 藥物的配制

參照文獻[4]配制Ⅱ型膠原乳劑及Gen混懸液。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型的建立

1.4.1.1 實驗動物分組及處理 24只大鼠隨機分成三組：空白對照組、模型對照組及Gen預防用藥組，每組8只大鼠。Gen預防用藥組大鼠在造模前1周開始每天胃內灌注Gen混懸液1 mL?？瞻讓φ战M以及模型對照組大鼠每天灌注等量羧甲基纖維素鈉。

1.4.1.2 造模 模型對照組和Gen預防用藥組大鼠左后足趾皮下注射0.1 mL Ⅱ型膠原乳劑，并于3周后在尾根部進行多點加強注射，空白對照組注射等量的注射用水。

1.4.2 動物模型的評價

關節(jié)炎指數(shù)（AI）評分及關節(jié)腫脹度測定，參照文獻[4]。

1.4.3 免疫組化檢測

在給藥4周后處死所有大鼠，常規(guī)病理學及免疫組化法檢測滑膜炎癥及血管新生，參照文獻[7]用Mouse Anti-CD31標記滑膜微血管，進行滑膜微血管密度（MVD）測定。

1.4.4 免疫印跡（Western blot）法檢測

造模4周后處死大鼠，心臟采血5 mL，分離血清，參照文獻[8]檢測Gen預防性用藥后CIA大鼠血清炎性因子（IL-1β、TNF-α）、血管新生相關調節(jié)因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）表達的變化。每個實驗樣本重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠造模后一般情況

造模組大鼠造模后當天后肢注射部位開始出現(xiàn)肢體腫脹，隨后發(fā)現(xiàn)對側和前肢關節(jié)也出現(xiàn)了腫脹，以后肢關節(jié)腫脹更為明顯，部分大鼠關節(jié)表面皮膚充血且有關節(jié)活動障礙。造模組大鼠與空白對照組大鼠相比，精神萎靡，進食減少，運動遲緩，體重增長減慢，毛發(fā)缺少光澤。

2.2 三組大鼠關節(jié)炎指數(shù)比較

AI評分結果顯示，空白對照組大鼠無關節(jié)炎性反應，從造模后1周開始，模型對照組的AI評分均明顯高于空白對照組（P < 0.05）；從第3周開始Gen預防用藥組AI評分低于模型對照組（P < 0.05），見圖1。分析足肢腫脹程度結果發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠關節(jié)腫脹于造模后開始增加，模型對照組于第3周達到高峰，Gen預防用藥組于第2周達到高峰，以后逐漸降低。見圖2。

2.3 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α表達比較

模型對照組大鼠IL-1β、TNF-α的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），Gen預防用藥組IL-1β、TNF-α的表達均明顯低于模型對照組（P < 0.05），但仍高于空白對照組大鼠（P < 0.05）。見圖3。

2.4 各組大鼠血清中VEGF表達比較

研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型對照組大鼠VEGF表達明顯升高（P < 0.05），Gen能明顯抑制CIA大鼠血清中VEGF表達（P < 0.05），但仍高于空白對照組。見圖4。

2.5 各組大鼠關節(jié)滑膜免疫組化結果及MVD比較

采用Mouse Anti-CD31標記關節(jié)滑膜組織中的內皮細胞，計數(shù)大鼠關節(jié)滑膜組織中單位密度的微血管數(shù)（圖5～6）。統(tǒng)計結果顯示，模型對照組大鼠關節(jié)滑膜中的微血管數(shù)目明顯多于空白對照組（P < 0.05）；Gen預防用藥組大鼠的關節(jié)滑膜微血管數(shù)目仍高于空白對照組，但明顯低于模型對照組（P < 0.05）。

2.6 各組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達比較

研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型對照組大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-9的表達均明顯升高（P < 0.05）；而Gen預防用藥組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP -9的表達水平明顯低于模型對照組，但仍高于空白對照組（P < 0.05）。見圖7。

3 討論

Gen是大豆中生物活性最強的異黃酮之一，現(xiàn)已證實Gen可用于預防和治療多種疾病[9-12]。TNF-α、IL-1β是RA發(fā)生的重要炎性細胞因子。TNF-α和IL-1β相互協(xié)同下促進RA關節(jié)滑膜組織增生；誘導關節(jié)成纖維樣滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生膠原酶和前列腺素E2；增加血管內皮細胞黏附分子表達，促使血管生成；影響糖蛋白的代謝，抑制骨形成，最終導致關節(jié)結構破壞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠與空白對照組相比，其血清中IL-1β、TNF-α的表達明顯增高（P < 0.05）；預防性給予Gen干預后，IL-1β、TNF-α表達明顯降低，但并未恢復到正常水平，提示Gen能夠通過部分調節(jié)CIA大鼠體內炎癥因子的表達而預防RA的發(fā)病。

血管新生失去控制是RA滑膜增生以及關節(jié)軟骨侵蝕的主要因素。研究表明，VEGF能促進新生血管的生成[14]。Yi等[15]研究證實，RA患者血清、關節(jié)滑膜組織和滑膜液中VEGF含量與疾病活動度具有相關性。RA病程中VEGF可誘導關節(jié)滑膜毛細血管內皮細胞增殖和遷移，引起關節(jié)滑膜血管新生及血管翳形成，并能通過增加毛細血管的通透性而促進炎性物質的滲出。新生血管形成的過程中首先是毛細血管內皮下基底膜被MMPs等物質降解，提示MMP-1、MMP-2、MMP-9在促進RA關節(jié)滑膜血管新生的過程中發(fā)揮重要作用[16-18]。關節(jié)滑液及滑膜組織中過量表達的MMP-1、MMP-2、MMP-9可通過降解關節(jié)軟骨成分直接參與RA關節(jié)軟骨基質的分解，最終導致骨結構破壞[19]。Sbardella等[20]研究表明，測定血清中MMPs含量可以間接反映關節(jié)滑液中MMPs的變化情況。本實驗結果顯示：Gen預防用藥組大鼠滑膜組織中的MVD明顯多于空白對照組（P < 0.05），但與模型對照組比明顯減少（P < 0.05）；Gen預防性干預后，可以明顯抑制CIA大鼠血清中VEGF表達（P <0.05）；且CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達水平明顯減低（P < 0.05）。這表明Gen可以通過下調CIA大鼠體內的VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9的表達抑制關節(jié)滑膜血管新生，并可直接阻止關節(jié)軟骨及骨的破壞以達到防止RA的發(fā)病的目的。

綜上所述，預防性應用Gen能夠下調炎性細胞因子（TNF-α和IL-1β）的表達；下調血管新生相關調節(jié)因子（VEGF和MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表達而抑制關節(jié)滑膜的血管新生，阻止關節(jié)軟骨及骨的破壞，對RA的發(fā)病有一定的預防作用。

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