用一種新方法檢測尼古丁減輕魚藤酮對UPS的毒性

石 婕，鄧永寧，劉 潔，屈秋民

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種以震顫、強直、運動遲緩為特征的常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，特征性病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進行性缺失，殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)α-Synuclein聚集形成的Lewy小體。泛素-蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)是真核細胞內(nèi)一條重要的蛋白降解途徑，可降解細胞內(nèi)突變、損傷、錯位及有害的蛋白質(zhì)，維持細胞的正常功能。當(dāng)UPS功能障礙時，異常蛋白不能得到及時降解而大量累積，會給細胞帶來很大毒性作用[1]。大量研究[2]證明，PD患者殘存細胞內(nèi)α-Synuclein聚集和Lewy小體形成與UPS功能障礙密切相關(guān)。目前，檢測UPS活性主要是測定UPS環(huán)路中各個亞單位的含量和功能，不能反映UPS的整體功能，也不能進行動態(tài)檢測，存在一定的局限性。本研究將采用一種新的方法，進行動態(tài)、全面的測量UPS的活性，并初步探討尼古丁對魚藤酮誘導(dǎo)的UPS功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1CL1-pEGFP-C1質(zhì)粒的構(gòu)建參考NONAKA等[3]的研究，選擇5′-TCGAGCTTGTAAAAATTGGTTTTCTTCTTTATCTCATTTTGTTATTCA-TTTATAAG-3′和5′-GATCCTTATAAATGAAT-AACAAAATGAGATAAAGAAGAAAACCAAT-TTTTACAAG-3′作為插入序列CL1，由西安晶彩生物技術(shù)有限公司負責(zé)合成鑒定。將兩條寡核苷酸鏈溶解于退火緩沖液，95 ℃加熱15 min，緩慢降至室溫，得到編碼蛋白酶體降解信號CL1(ACKNWFSSLSHFVIHL)的DNA片斷。將該片段與BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的質(zhì)粒pEGFP-C1連接，得到CL1-pEGFP-C1質(zhì)粒。將改建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細菌, 挑選單菌落送西安晶彩生物技術(shù)有限公司測序鑒定。選擇序列正確的質(zhì)粒擴增，提取CL1-pEGFP-C1質(zhì)粒DNA。

1.2CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立用TurbofectinvitroTransfection Reagent將CL1-pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC12細胞，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用含有800 μg/mL G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。2周后，無菌微量槍頭挑取轉(zhuǎn)染形成的單克隆，于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。如此挑取多個細胞克隆后，以維持劑量400 μg/mL G418繼續(xù)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)2～4周后，建立穩(wěn)定表達CL1-pEGFP-C1的細胞系。

1.3采用蛋白酶體抑制劑處理轉(zhuǎn)染細胞將CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待細胞生長至70%～80%豐度時，分別加入不同劑量(1、10、100 μmol/L)的蛋白酶體抑制劑MG132，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP熒光強度，或提取細胞質(zhì)進行免疫印跡，觀察GFP表達。

1.4采用尼古丁和魚藤酮處理轉(zhuǎn)染細胞CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待細胞生長至70%～80%豐度時，分別加入不同劑量(1×10-6mol/L、1×10-4mol/L )尼古丁預(yù)處理30 min后給予魚藤酮(5×10-6mol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，或者直接給予魚藤酮(5×10-6mol/L)培養(yǎng)24 h，隨后用熒光顯微鏡觀察檢測各組熒光細胞出現(xiàn)的情況及用免疫印跡法觀察GFP含量。

1.5熒光顯微鏡的觀察CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，待細胞生長至70%～80%豐度時，進行相應(yīng)處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察熒光強度并拍照。

1.6免疫印跡分析收集細胞，加細胞裂解液勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清以分光光度計檢測樣品蛋白含量，取等量蛋白樣品用100 g/L SDS-PAGE膠進行電泳，恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下將PVDF膜在含50 mL/L奶粉的PBS中封閉1 h，封閉后于兔抗鼠GFP抗體中(1∶800，華肽先鋒)4 ℃孵育過夜。然后，在過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000，皮爾斯)中孵育1 h，以上兩步驟間用PBS充分漂洗。反應(yīng)后的PVDF膜在化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)5 min(避光)，然后將X光片放在PVDF膜上曝光，手動沖洗膠片。

2 結(jié) 果

2.1CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中GFP的表達CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中UPS功能正常，可特異性識別CL1降解信號，從而降解CL1-GFP蛋白，在熒光顯微鏡下無GFP熒光表達(圖1)。

圖1CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的熒光顯微鏡觀察

Fig.1 Fluorescent microscopic observation of CL1-pEGFP-C1 cells

2.2MG132對UPS功能的影響應(yīng)用不同濃度的UPS抑制劑MG132(1、10、100 μmol/L)處理CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)綠色熒光強度。如圖2所示，隨著MG132濃度的增高，細胞內(nèi)綠色熒光強度逐漸增加，提示GFP表達增多。收集細胞提取蛋白質(zhì)，免疫印跡法檢測GFP蛋白表達，可見隨著MG132濃度的增高，GFP表達逐漸增多(圖3)。

圖2不同濃度MG132對CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞熒光強度的影響

Fig.2 The effect of MG132 on fluorescent intensity of GFP in CL1-pEGFP-C1 cells

A：CL1-pEGFP- C1轉(zhuǎn)染細胞；B：1 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；C：10 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；D：100 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞。

圖3不同濃度MG132處理后CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞GFP蛋白的表達

Fig.3 GFP protein expression in CL1-pEGFP-C1 cells

1：pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；2：CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；3：100 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；4：10 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；5：1 μmol/L MG132處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞。**P<0.05,vs. 3、4和5;*P<0.05,vs. 5。

2.3尼古丁和魚藤酮對UPS功能的影響正常CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞無綠色熒光，而魚藤酮處理后，CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)綠色熒光明顯增加。魚藤酮+低濃度尼古丁處理后，細胞內(nèi)綠色熒光明顯較魚藤酮單獨處理組減少；魚藤酮+高濃度尼古丁處理后，細胞內(nèi)綠色熒光進一步減少。提示魚藤酮可以損害UPS功能，而尼古丁可減輕魚藤酮引起的UPS功能障礙(圖4)。

免疫印跡法檢測細胞內(nèi)GFP表達顯示，正常CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞GFP表達很少，而魚藤酮處理組GFP表達明顯增加。魚藤酮+低濃度尼古丁處理組GFP表達明顯低于魚藤酮單獨處理組；魚藤酮+高濃度尼古丁處理組細胞內(nèi)GFP表達進一步減少。提示魚藤酮可以抑制UPS功能，減少細胞內(nèi)GFP降解，而尼古丁可劑量依賴性減輕魚藤酮引起的UPS功能障礙(圖5)。

3 討 論

UPS是真核細胞內(nèi)降解異常蛋白的重要途徑。UPS功能障礙與PD患者腦內(nèi)α-Synuclein聚集及Lewy小體形成密切相關(guān)，是PD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。調(diào)節(jié)UPS的功能，對于延緩PD發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

圖4尼古丁和魚藤酮對CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞GFP熒光強度的影響

Fig.4 The effect of rotenone and nicotine on fluorescent intensity of GFP in CL1-pEGFP-C1 cells

A：CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；B：5×10-6mol/L魚藤酮處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；C：5×10-6mol/L魚藤酮+低濃度尼古丁(1×10-6mol/L)處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；D：5×10-6mol/L魚藤酮+高濃度尼古丁(1×10-4mol/L)處理的CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞。

圖5尼古丁和魚藤酮對CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞GFP蛋白表達的影響

Fig.5 GFP expression in CL1-pEGFP- C1 cells treated with rotenone and nicotine

1：5×10-6mol/L魚藤酮處理組；2：CL1-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細胞；3：5×10-6mol/L魚藤酮+高濃度尼古丁(1×10-4mol/L)處理組；4：5×10-6mol/L魚藤酮+低濃度尼古丁(1×10-6mol/L)處理組。**P<0.01,vs. 2、3和4;*P<0.01,vs. 3和4。

目前，常用的測量UPS功能的方法有如下幾種：一種是給予UPS通路中的關(guān)鍵酶(糜蛋白酶、胰蛋白酶、谷氨酰水解酶)特異性熒光底物，通過熒光酶標(biāo)儀檢測未被分解的底物含量來反映關(guān)鍵酶的活性，從而間接反映UPS的功能[4]。然而, 該方法只能檢測UPS中3種關(guān)鍵酶的活性，不能反映UPS降解過程的其他步驟(如泛素化等)。另一種方法是將蛋白酶體降解底物進行同位素標(biāo)記，體外泛素化后再與蛋白酶體孵育，通過測定放射性的變化反映蛋白酶體活性[5]。但是，該方法同樣不能反映降解底物的泛素化等過程。還有研究通過測量UPS中某些組分含量來反映UPS功能，但這樣不能全面的反映UPS。而且用以上方法檢測組織中的蛋白酶體活性時, 必須將被檢測組織制成勻漿，而在某些疾病的發(fā)生中，UPS活性的下降只是發(fā)生在某種或某些特定細胞中[6]，這些檢測方法不能檢測活細胞內(nèi)的UPS活性，更不能檢測單個細胞內(nèi)的UPS活性的變化。

GILON等[7]發(fā)現(xiàn)了一系列多肽序列, 其可被UPS特異性降解，這類多肽序列稱為UPS降解信號。有研究[7]將其中一種被稱為CL1的降解信號和GFP融合并轉(zhuǎn)染入細胞，從而使GFP的半衰期明顯縮短，用蛋白酶體抑制劑處理可使GFP-CL1在細胞內(nèi)出現(xiàn)劑量依賴性累積，從而建立了一種檢測UPS活性的新方法。我們根據(jù)前人的研究將CL1與GFP融合，成功地建立了CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。當(dāng)UPS功能正常時，細胞內(nèi)表達的CL1-GFP蛋白可以迅速被降解，細胞不表達綠色熒光；當(dāng)UPS功能障礙時，細胞內(nèi)表達的CL1-GFP蛋白不能被及時降解，細胞表達綠色熒光。蛋白酶體抑制劑MG132可特異性抑制UPS功能，MG132處理后細胞內(nèi)綠色熒光顯著增加，且隨著MG132濃度增加，GFP表達劑量依賴性增高。說明本研究建立的CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系能夠全面、動態(tài)的反映UPS功能。

魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細胞損傷是常用的PD細胞模型，其機制可能與魚藤酮引起UPS功能障礙，神經(jīng)元損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮可引起NO和過氧化物水平的升高從而引起UPS功能障礙[8]；引起20S蛋白酶體活性降低及20S蛋白酶亞基免疫反應(yīng)[9]，通過被氧化的蛋白或者氧化修飾的蛋白酶體自身聚集來誘導(dǎo)UPS功能障礙[10]。還有研究提示魚藤酮誘導(dǎo)的UPS功能障礙可能與由氧化應(yīng)激、微管蛋白障礙引起的蛋白酶體成分降解有關(guān)[11]。本研究使用CL1-pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系發(fā)現(xiàn)，魚藤酮處理后，細胞內(nèi)綠色熒光顯著增加，免疫印跡檢測GFP表達顯著增加，證明魚藤酮可損傷UPS功能，減少細胞內(nèi)CL1-GFP蛋白的降解。

吸煙是PD的保護因素，可能通過尼古丁與多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)末梢上的尼古丁受體(nAChRs)結(jié)合發(fā)揮作用[12]。有研究顯示，尼古丁可上調(diào)UPS功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13]。KANE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可上調(diào)泛素、泛素結(jié)合酶、20S、19S蛋白酶體的功能；人體研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者的呼吸道上皮中UCHL1含量上升，而UCHL1是UPS的重要組成成分之一[15]。但是，這些研究僅檢測UPS中某些成分的含量，而非UPS的整體功能。本研究采用魚藤酮誘導(dǎo)的PD細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁處理后，細胞內(nèi)綠色熒光強度較魚藤酮處理組顯著減少，GFP表達顯著降低，尤其高濃度尼古丁處理后，細胞內(nèi)綠色熒光減少及GFP蛋白表達降低更加顯著，說明尼古丁可以增加UPS對細胞內(nèi)CL1-GFP蛋白的降解，可以改善魚藤酮誘導(dǎo)的UPS功能障礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

通過本研究，我們建立了一種能夠動態(tài)、全面觀測UPS功能的方法，利用該方法研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮可引起UPS功能障礙，而尼古丁可減輕魚藤酮的這一毒性作用。為研究UPS在PD發(fā)病中的作用以及藥物作用的機制提供了有效方法。

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