肺腺癌組織學(xué)亞型與EGFR突變及臨床特征的關(guān)系

趙艷秋，劉 杰，劉瑞青，張建波，孫曉楠，王 喻，李醒亞

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州 450008； 2.河南省人民醫(yī)院介入科，河南鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州 450003)

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見病因[1]，其中腺癌作為肺癌中最常見的組織學(xué)亞型，無論在男性還是在女性近年來發(fā)生率都逐漸增加[2]。肺腺癌組織異質(zhì)性很大，亞型分類復(fù)雜多樣，目前其主要的亞型分類標(biāo)準(zhǔn)包括2004年的WHO分類[3]和2011年國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)、美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)(IASLC/ATS/ERS)聯(lián)合推出的肺腺癌國(guó)際多學(xué)科分類新標(biāo)準(zhǔn)[4]。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變和肺腺癌的某些特殊亞型相關(guān)，如伏壁樣為主型腺癌(原來的非黏液性BAC)具有更高的EGFR突變率[5-6]，對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑也更為敏感[7-8]。另外一些相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與含乳頭狀和微乳頭狀亞型成分的腺癌呈正相關(guān)[5,9-11]；與此相反，黏液性BAC的EGFR突變率卻非常低[12-13]。中國(guó)肺腺癌人群具體組織學(xué)亞型與EGFR突變狀態(tài)之間的關(guān)系并不十分清楚，需要進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究的內(nèi)容主要包括：①結(jié)合肺腺癌2004年WHO分類和2011年IASLC/ATS/ERS分類，分析肺腺癌組織學(xué)亞型與EGFR突變狀態(tài)之間的關(guān)系；②EGFR突變狀態(tài)與臨床病理特征之間的關(guān)系分析。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009～2011年確診的肺腺癌患者標(biāo)本206例，入組患者均有EGFR突變檢測(cè)結(jié)果。206例患者中女性99例(48.1%)，男性107例(51.9%)，年齡31～81歲，平均年齡58.6歲；非吸煙患者129例(62.6%)，吸煙患者77例(37.4%)；臨床分期采用2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)公布的修訂后的第7版國(guó)際肺癌分期法，其中Ⅰ期59例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例、Ⅳ期67例。EGFR突變患者91例(44.2%)，其中19外顯子缺失突變39例(18.9%)，21外顯子突變52例(25.2%)；穿刺活檢標(biāo)本62例(30.1%)，手術(shù)標(biāo)本144例(69.9%)。入組患者的臨床病理特征如表1所示。

1.2方法

1.2.1亞型鑒定 206例患者原始HE切片從醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)中重新調(diào)閱，經(jīng)2位高年資的病理醫(yī)師盲法審閱，重新病理確診及亞型鑒定，意見不一致的樣本重新商討并達(dá)成一致觀點(diǎn)。分型標(biāo)準(zhǔn)參考2004年WHO分類系統(tǒng)和2011年IASLC/ATS/ERS分類方法，按照以下兩種方式進(jìn)行評(píng)估：①參考2004年WHO分類系統(tǒng)(亞型成分的比例大于10%時(shí)認(rèn)為含有此種亞型成分)，按照是否含有某種組織學(xué)亞型成分進(jìn)行分類(如含腺泡成分組和不含腺泡成分組)；②依據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)中全面的組織學(xué)分型原則，以5%的增量半定量法評(píng)估組織學(xué)類型，并選擇一種作為主要類型，可分為伏壁樣生長(zhǎng)為主型(以前的非黏液性BAC，LPD)、腺泡樣為主型(ACI)、乳頭狀為主型(PAP)、微小乳頭狀為主型(MIP)、實(shí)體型為主型(SOL)、浸潤(rùn)性黏液腺癌(以前的黏液性BAC，IMA)6型。本研究入組患者中共有144例手術(shù)樣本，腺癌為139例，其中122例混合性腺癌可參照分型標(biāo)準(zhǔn)重新評(píng)估亞型，11例單一亞型腺癌，6例由于分化程度低、組織標(biāo)本過少等原因不能重新評(píng)估亞型，另有5例為其他類型非小細(xì)胞肺癌(包括4例腺鱗癌，1例鱗癌)。

1.2.2EGFR突變的檢測(cè) 采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng) (amplification refractory mutation system，ARMS)法檢測(cè)EGFR熱點(diǎn)突變基因(19和21外顯子)的突變情況，熒光定量PCR的儀器號(hào)為：Stratagene Mx30009(德國(guó))。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)分析方法采用卡方檢驗(yàn)以及Fisher精確概率法，當(dāng)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床病理特征與EGFR突變的關(guān)系206例入組患者中，EGFR突變率為44.2%(91/206)，其中女性比男性具有更高的突變率(56.6%vs. 32.7%，P=0.001)；不吸煙患者比吸煙患者具有更高的突變率(51.9%vs. 31.2%，P=0.004)；綜合分析后發(fā)現(xiàn)，女性、不吸煙、腺癌患者的EGFR突變率達(dá)57.6%(53/92)。EGFR突變狀態(tài)與年齡、樣本類型(手術(shù)樣本和活檢樣本)及疾病分期無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1EGFR突變與臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab.1 Relationship between EGFR mutation and clinicopathologic characteristics

臨床病理特征例數(shù)[n(%)]EGFR突變型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2P性別 男 女107(51.9)99(48.1)35(32.7)56(56.6)72(67.3)43(43.4)11.8660.001年齡(歲) ≥65 <6563(30.6)143(69.4)29(46.0)62(43.4)34(54.0)81(56.6)0.1270.722吸煙史 有 無77(37.4)129(62.6)24(31.2)67(51.9)53(68.8)62(48.1)8.4340.004分期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期94(45.6)112(54.4)43(45.7)44(39.3)51(54.3)68(60.7)0.8740.350穿刺活檢62(30.1)26(41.9)36(58.1) 腺癌59(95.2)25(42.4)34(57.6) 非腺癌 3(4.8)1(33.3) 2(66.7)手術(shù)標(biāo)本144(69.9)66(45.8)78(54.2)0.2660.606a 腺癌139(96.5)65(46.8)74(53.2) 亞型可評(píng)估122(87.8)59(48.4)63(51.6) 非腺癌 5(3.5)1(20.0) 4(80.0)合計(jì)20691(44.2)115(55.8)

a：比較穿刺活檢標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本的EGFR突變狀態(tài)。

2.2組織學(xué)亞型特征及其與EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系參考2004年WHO分類，122例混合性腺癌中最常見的組織學(xué)亞型成分是腺泡型(ACI，76.2%)，其次是非黏液性BAC(42.6%)、乳頭型(PAP，15.6%)、實(shí)體型(SOL，5.7%)和黏液性BAC(12.3%)。含有BAC成分的腺癌比不含此類成分的腺癌突變率更高(61.5%vs. 38.6%,P=0.012)，含有PAP成分的腺癌傾向比不含此成分的腺癌突變率高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.057)；相反，EGFR突變?cè)诤ひ盒訠AC成分的腺癌中比不含此類成分的腺癌突變率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.3%vs. 53.3%,P=0.004，表2)。

依照2011年IASLC/ATS/ERS分類，最常見的亞型成分是腺泡樣為主型(45.1%，55/122)，其次是伏壁樣生長(zhǎng)為主型(20.5%，25/122)、乳頭狀為主型(9.8%，12/122)、浸潤(rùn)性黏液腺癌(9.0%，11/122)、微小乳頭狀為主型(4.1%，5/122)和實(shí)體型為主型(3.3%, 4/122)。乳頭狀為主型具有較高的EGFR突變率(66.7%)，而浸潤(rùn)性黏液腺癌(27.3%)和實(shí)體型為主型(25%)突變率較低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳頭狀為主型腺癌EGFR突變率比實(shí)體型為主型和浸潤(rùn)性黏液腺癌更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.057，表3)。

表2腺癌標(biāo)本中含或不含某種亞型成分與EGFR突變的關(guān)系

Tab.2 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes with and without certain components in the resected specimens

分類合計(jì)[n(%)]EGFR突變型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2PBAC 有 無52(42.6)70(57.4)32(61.5)27(38.6)20(38.5)43(61.4)6.3020.012PAP 有 無19(15.6)103(84.4)13(68.4)46(44.7)6(31.6)57(55.3)3.6260.057ACI 有 無93(76.2)29(23.8)48(51.6)11(37.9)45(48.4)18(62.1)1.6570.198黏液BAC 有 無15(12.3)107(87.7)2(13.3)57(53.3)13(86.7)50(46.7)8.4020.004SOL 有 無 7(5.7)115(94.3)1(14.3)58(50.4)6(85.7)57(49.6)2.1570.142

表3依據(jù)2011年IASLC/ATS/ERS新分類法組織亞型與EGFR突變的關(guān)系

Tab.3 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes according to new IASLC/ATS/ERS classification method

組織亞型例數(shù)[122(100%)]EGFR突變型[59(48.4%)]EGFR野生型[63(51.6%)]P腺泡樣為主型55(45.1)23(41.8)32(58.2)伏壁樣生長(zhǎng)為主型25(20.5)12(48.0)13(52.0)乳頭狀為主型12(9.8)8(66.7)4(33.3)微小乳頭狀為主型5(4.1)2(40.0)3(60.0)浸潤(rùn)型黏液腺癌11(9.0)3(27.3)8(72.7)實(shí)體性為主型4(3.3)1(25)3(75.0)0.057a

A：分析方法為Fisher確切概率法(乳頭狀為主型 versus浸潤(rùn)型黏液腺癌+實(shí)體性為主型)。

3 討 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，亞裔、不吸煙、女性、肺腺癌患者是EGFR-TKI治療的優(yōu)勢(shì)人群[14]。在本研究中，入組患者均為腺癌，總的EGFR突變率為44.2%(91/206)，其在女性(P=0.001)、不吸煙(P=0.004)患者中突變率更高，同時(shí)符合女性、不吸煙、腺癌3個(gè)特征的患者EGFR突變率達(dá)57.6%(53/92)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

2004年的WHO分類承認(rèn)，80%～90%的肺腺癌均為混合性腺癌，單純型腺癌很少見[3]。在最近的幾年里，肺癌研究的主要進(jìn)展大多集中在肺腺癌這一亞型上，人們逐漸發(fā)現(xiàn)基于病理學(xué)的肺腺癌分類方法已無法適應(yīng)多學(xué)科參與的個(gè)體化治療模式。在此背景下，2011年IASLC/ATS/ERS聯(lián)合推出了肺腺癌的國(guó)際多學(xué)科分類新標(biāo)準(zhǔn)[4]。在肺腺癌亞型的研究中，國(guó)外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其與EGFR突變狀態(tài)密切相關(guān)，并認(rèn)為EGFR突變?cè)诜丘ひ盒訠AC、乳頭狀和微乳頭狀腺癌亞型中發(fā)生率更高，而在其他組織學(xué)亞型中發(fā)生率較低，尤其在黏液性BAC亞型中EGFR突變率更低[5-13]。在本研究中，我們結(jié)合2004年WHO分類系統(tǒng)和2011年IASLC/ATS/ERS新分類標(biāo)準(zhǔn)，探討了國(guó)內(nèi)肺腺癌人群中組織形態(tài)學(xué)特征能否反映EGFR的突變狀態(tài)。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，含非黏液性BAC成分的腺癌EGFR突變率更高，而含黏液性BAC成分的腺癌EGFR突變率更低；以乳頭狀為主型腺癌的EGFR突變率高于浸潤(rùn)型黏液腺癌和實(shí)體性為主型腺癌。

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，與非黏液BAC相比，含乳頭狀成分的混合型腺癌突變率也很高[9,13]，乳頭型常被認(rèn)為是BAC的進(jìn)展形式[15]，兩者之間的生物學(xué)聯(lián)系和區(qū)別還需進(jìn)一步的研究。在本研究中雖然含乳頭狀成分的腺癌突變率較高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.057)，可能是入組樣本數(shù)量過少的原因。

關(guān)于組織學(xué)亞型與EGFR突變之間存在密切聯(lián)系的真正原因，目前仍不是很清楚。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，外周型肺腺癌主要起源于終末細(xì)支氣管的Clara(克拉拉)細(xì)胞和肺癌Ⅱ型上皮細(xì)胞，在該型腺癌中，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)的表達(dá)常為陽性，位于中央氣道的腺癌主要起源于支氣管基底細(xì)胞和黏液分泌細(xì)胞，TTF-1的表達(dá)為陰性。層序聚類分析也提示，兩個(gè)差異的基因簇分別對(duì)應(yīng)終末呼吸單位(TRU)和非終末呼吸單位(N-TRU)來源的腺癌。日本學(xué)者YATABE等[6,16]發(fā)現(xiàn)，TRU來源的腺癌是一種特別的腺癌類型，與細(xì)支氣管肺泡癌(BAC)特征非常符合，表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞學(xué)形態(tài)以及TTF-1和細(xì)胞表面蛋白表達(dá)。在149例TRU腺癌中，EGFR突變率為61.1%，97例EGFR突變患者中，高達(dá)91例(93.8%)為TRU腺癌。TRU腺癌預(yù)測(cè)EGFR突變具有高的敏感性和特異性，對(duì)EGFR-TKI治療更為有效。

日本學(xué)者YOSHIDA等[17]為了研究組織學(xué)亞型與EGFR突變間的關(guān)系，檢測(cè)了54例肺不典型腺瘤樣增生(肺腺癌的前期病變)的EGFR突變情況，并未發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者和未突變患者之間存在明顯的組織學(xué)差異，并且由于不典型腺瘤樣增生患者的EGFR突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非黏液性BAC腺癌，作者猜測(cè)發(fā)生EGFR突變的不典型腺瘤樣增生在后來的疾病進(jìn)展中很可能發(fā)展為非黏液性BAC腺癌。SAKUMA 等[18]為了研究EGFR突變和含BAC成分腺癌之間的關(guān)系，把114例非小細(xì)胞肺癌分為含黏液成分BAC、不含黏液成分BAC和不含BAC成分的腺癌，利用高靈敏度PCR方法檢測(cè)EGFR和KRAS突變狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，非黏液性BAC和黏液性BAC成分同EGFR和KRAS突變狀態(tài)之間存在著密切的聯(lián)系，由于88%含非黏液性BAC成分的腺癌都檢測(cè)到了EGFR突變。作者推斷EGFR突變可能是含非黏液性BAC成分的原位肺腺癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵性事件。

在人類肺癌組織中，TTF-1主要在終末細(xì)支氣管的Clara(克拉拉)細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中陽性表達(dá)，是肺腺癌的譜系特異性致癌基因，而鱗癌和大細(xì)胞癌很少表達(dá)[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TTF-1主要表達(dá)在非黏液性肺腺癌中[21]。那么，與肺腺癌組織學(xué)特征密切聯(lián)系的TTF-1表達(dá)水平與EGFR突變之間是否存在聯(lián)系，我們將在隨后的研究中進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] SIEGEL R, WRAD E, BRAWLEY O, et al. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(4):212-236.

[2] DEVESA SS, BRAY F, VIZCAINO AP, et al. International lung cancer trends by histologic type: male: female differences diminishing and adenocarcinoma rates rising[J]. Int J Cancer, 2005, 117(2):294-299.

[3] TRAVIS WD, BRAMBILLA E, MULLER-HERMELINK HK, et al. World health organization classification of tumours. Pathology and genetics. tumours of the lung, pleura, thymus and heart[M]. Lyon, France: IARC Press, 2004.

[4] TRAVIS WD, BRAMBILLA E, NOGUCHI M, et al. International association for the study of lung cancer/American thoracic society/European respiratory society: international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma[J]. J Thorac Oncol, 2011, 8(5):381-385.

[5] INAMURA K, NINOMIVA H, ISHIKAWA Y, et al. Is the epidermal growth factor receptor status in lung cancers reflected in clinicopathologic features?[J]. Arch Pathol Lab Med, 2010, 134: 66-72.

[6] YATABE Y, KOSAKA T, TAKAHASHI T, et al. EGFR mutation is specific for terminal respiratory unit type adenocarcinoma[J]. Am J Surg Pathol, 2005, 29:633-639

[7] MILLER VA, RIELY GJ, ZAKOWSKI MF, et al. Molecular characteristics of bronchioloalveolar carcinoma and adenocarcinoma, bronchioloalveolar carcinoma subtype, predict response to erlotinib[J]. J Clin Oncol, 2008, 26:1472-1478.

[8] MILLER VA, KRIS MG, SHAH N, et al. Bronchioloalveolar pathologic subtype and smoking history predict sensitivity to gefitinib in advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2004, 22:1103-1109.

[9] NINOMIVA H, HIRAMATSU M, INAMURA K, et al. Correlation between morphology and EGFR mutations in lung adenocarcinomas: significance of the micropapillary pattern and the hobnail cell type[J]. Lung Cancer, 2009, 63:235-240.

[10] KIM YH, ISHII G, GOTO K, et al. Dominant papillary subtype is a significant predictor of the response to gefitinib in adenocarcinoma of the lung[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10:7311-7317.

[11] MOTOI N, SZOKE J, RIELY GJ, et al. Lung adenocarcinoma: modification of the 2004 WHO mixed subtype to include the major histologic subtype suggests correlations between papillary and micropapillary adenocarcinoma subtypes, EGFR mutations and gene expression analysis[J]. Am J Surg Pathol, 2008, 32:810-827.

[12] FINBERG KE, SEQUIST LV, JOSHI VA, et al. Mucinous differentiation correlates with absence of EGFR mutation and presence of KRAS mutation in lung adenocarcinomas with bronchioloalveolar features[J]. J Mol Diagn, 2007, 9:320-326.

[13] SUN PL, SEOL H, LEE HJ, et al. High incidence of EGFR mutations in Korean men smokers with no intratumoral heterogeneity of lung adenocarcinomas[J]. J Thorac Oncol, 2012, 7(2):323-330.

[14] MOK TS, WU YL, THONGPRASERT S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. N Engl J Med, 2009, 361:947-957.

[15] JIAN Z, TOMIZAWA Y, YANAGITANI N, et al. Papillary adenocarcinoma of the lung is a more advanced adenocarcinoma than bronchioloalveolar carcinoma that is composed of two distinct histological subtypes[J]. Pathol Int, 2005, 55:619-625.

[16] YATABE Y. EGFR mutations and the terminal respiratory unit[J]. Cancer Metastasis Rev, 2010, 29:23-36.

[17] YOSHIDA Y, SHIBATA T, KOKUBU A, et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene in atypical adenomatous hyperplasia and bronchioloalveolar carcinoma of the lung[J]. Lung Cancer, 2005, 50:1-8.

[18] SAKUMA Y, MATSUKUMA S, YOSHIHARA M, et al. Distinctive evaluation of nonmucinous and mucinous subtypes of bronchioloalveolar carcinomas in EGFR and K-ras gene-mutation analyses for Japanese lung adenocarcinomas: confirmation of the correlations with histologic subtypes and gene mutations[J]. Am J Clin Pathol, 2007, 128:100-108.

[19] KIM YH, ISHII G, GOTO K, et al. Dominant papillary subtype is a significant predictor of the response to gefitinib in adenocarcinoma of the lung[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10:7311-7317.

[20] KWEI KA, KIM YH, GIRARD L et al. Genomic profiling identifies TITF1 as a lineage-specific oncogene amplified in lung cancer[J]. Oncogene, 2008, 27:3635-3340.

[21] KAUFMANN O, DIETEL M. Thyroid transcription factor-1 is the superior immunohistochemical marker for pulmonary adenocarcinomas and large cell carcinomas compared to surfactant proteins A and B[J]. Histopathology, 2000, 36(1):8-16.