通腦溶栓膠囊對大鼠血栓形成和血液流變學(xué)的影響

王紅英，黃琳紅，馬耀茹，賀建宇

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究所，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬紅會醫(yī)院，陜西西安 710054；3. 西安洲良明康生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西西安 710075)

中風(fēng)是中老年的常見病、多發(fā)病，是當今世界對人類危害最大的3種疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥多的“四高一多”特點。近年來，由于診療水平的提高，中風(fēng)的死亡率有所降低，但致殘率仍居高不下，約80%的存活者尚有不同程度的功能障礙，即中風(fēng)后遺癥，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔[1]。有研究表明，血液流變學(xué)狀態(tài)的改變在心腦血栓形成至最終發(fā)展為心腦梗死的過程中起到重要作用[2]。通腦溶栓膠囊由黃芪、粉葛、川芎、桃仁、雞血藤、地龍等中藥材組成的中藥新藥，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效，臨床主治中風(fēng)恢復(fù)期(腦梗死)所致的半身不遂、口眼歪斜、偏身感覺麻木、肢體痙攣、語言不利等屬氣虛血瘀證者。本研究通過制備大鼠體內(nèi)血栓模型，觀察通腦溶栓膠囊對體內(nèi)血栓形成和血液流變學(xué)的影響，探討其活血化瘀的作用機制，為該復(fù)方制劑的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器通腦溶栓膠囊(陜西博森生物制藥股份集團有限公司，規(guī)格：0.4 g/粒，批號：081201)；血栓心脈寧膠囊(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.5 g/粒，批號：081102)；3 g/L戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，批號：060222)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，成都科龍化工試劑廠，批號：20081120)；磷酸緩沖液、EDTA緩沖液、EDTA-甲醛緩沖液；100 g/L高分子右旋糖酐(DEXTRAN500，Amersham Biosciences，批號：301622)；5 g/L肝素生理鹽水溶液(天津市生物化學(xué)制藥廠，批號：20120205)；EDTA(浙江拱東醫(yī)用塑料廠，批號：0603147)。多道生理機能儀(成都儀器廠，型號：6280C)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，AB204-N)；血細胞自動分析儀(日本光電公司，MEK-6318K)；血凝儀(中山市培康醫(yī)療電子有限公司，PK-B)；臺式冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16G)；血黏度分析儀(北京宏潤科技發(fā)展有限公司，型號：YDA-IV)；100 g/L水合氯醛(分析純，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科)。

1.2實驗動物SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物生產(chǎn)資格證號：SCXK(陜)2007-001，動物使用許可證號：SYXK(陜)2007-003。動物顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3方法

1.3.1動物分組及給藥方法 將3批各50只SD大鼠隨機分為5組：陰性對照組、陽性對照組(血栓心脈寧膠囊)及通腦溶栓膠囊低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。陰性對照組灌胃給予5 g/L的CMC-Na，其余各組給予對應(yīng)的受試品CMC-Na混懸液，按1 mL/100 g 給藥，1次/d，分別進行動、靜脈血栓模型及血小板聚集實驗；另取60只大鼠隨機分為6組：對照組、模型組、陽性組及通腦溶栓膠囊低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半，進行血瘀大鼠血液流變學(xué)實驗。

1.3.2頸總動脈血栓模型的制備[3]連續(xù)給藥25 d后，腹腔注射3 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，頸正中切口，分離、動脈夾結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。缺血1 h后灌胃給藥，繼續(xù)缺血1 h后解除動脈夾實施再灌注，血流再通，縫合切口，自由飲食飼養(yǎng)24 h。電流設(shè)定4 mA，刺激時間7 min，之后縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)，手術(shù)均為無菌操作。再連續(xù)灌胃給藥5 d，末次給藥1 h后，再次麻醉大鼠，頸正中切口，取出包含血栓的頸總動脈，分離血栓，在濾紙上吸干血液與水分，稱量血栓重量。

1.3.3靜脈血栓模型的制備[4]連續(xù)給藥30 d后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，腹中線切口，分離下腔靜脈，用粗線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，縫合切口。4 h后，重新打開腹腔，在結(jié)扎下方2 cm處夾閉管腔，剖開該段管腔，并將管腔內(nèi)血液吸盡，取出血栓，放濾紙上，吸干血液，稱量血栓濕重。

1.3.4血小板聚集及凝血指標的測定[5]連續(xù)給藥30 d，末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)麻醉，用內(nèi)徑1 mm的玻璃毛細管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細管血柱達5 cm。每隔30 s折斷毛細管一段，檢查有無出現(xiàn)凝血絲，計算毛細管采血到出現(xiàn)凝血絲的時間，即為凝血時間。然后仰臥位固定大鼠，開腹暴露腹主動脈和下腔靜脈，用分別裝有2 mL EDTA緩沖液和EDTA-甲醛緩沖液的5 mL注射器下腔靜脈采血0.5 mL，棄去注射器頭部的血液約0.1 mL，將余下的血液分別注入5 mL塑料離心管中，混勻，室溫放置15 min，以500 r/min離心10 min，取上層血漿，測定血小板計數(shù)(PLT)，計算血小板聚集率(PAgT)。

PAgT=[PLT(EDTA緩沖液)-PLT(EDTA-甲醛緩沖液)]/PLT(EDTA緩沖液)×100%。

另用32.1 g/L檸檬酸鈉和EDTA·K2真空采血管分別從腹主動脈采血，立即測定凝血酶時間(TT)、血漿凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)。

1.3.5血液流變學(xué)指標的測定 連續(xù)給藥30 d，末次給藥后1 h，各組大鼠尾靜脈注射100 g/L高分子右旋糖酐(0.5 mL/100 g)，15 min后，腹主動脈取血6～7 mL，1 mL全血EDTA抗凝測定紅細胞壓積(HCT)，0.8 mL全血肝素抗凝測定全血黏度，剩余血液3 000 r/min離心15 min，測血漿黏度。

2 結(jié) 果

2.1通腦溶栓膠囊對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響與陰性對照組比較，陽性對照組的頸動脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明實驗方法可靠。與陰性對照組比較，通腦溶栓中、高劑量組動脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01，表1)。

與陰性對照組比較，陽性對照組的下腔靜脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明實驗方法可靠。與陰性對照組比較，通腦溶栓低、中、高劑量組靜脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01，表2)。

表1通腦溶栓膠囊對大鼠體內(nèi)動脈血栓形成的影響

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2通腦溶栓膠囊對大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響

Tab.2 Effects of Tong-nao thrombolysis capsule on venous thrombosis in rats

n=10)

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2通腦溶栓膠囊對大鼠血小板聚集及凝血功能的影響與陰性對照組比較，陽性對照組血栓心脈寧膠囊可延長凝血時間及PT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；通腦溶栓膠囊低劑量組可延長APTT，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；通腦溶栓膠囊中劑量組能延長血凝時間及PT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；通腦溶栓膠囊高劑量組，可延長PT及APTT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表3)。

表3通腦溶栓膠囊對大鼠凝血時間、血小板功能及抗凝血作用的影響

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3通腦溶栓膠囊對血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響與陰性對照組比較，大鼠尾靜脈注射100 g/L高分子右旋糖酐后，模型對照組的各項血液流變學(xué)指標均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，說明血瘀模型制備成功。與模型對照組比較，陽性對照組和通腦溶栓高劑量組的全血高切變率、中切變率、低切變率及血漿黏度均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，通腦溶栓中劑量組的全血高切變率、中切變率及血漿黏度均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4通腦溶栓膠囊對血瘀大鼠模型血液流變學(xué)的影響

與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

3 討 論

腦梗死是缺血性腦血管疾病，血栓或栓塞性血管阻塞在缺血性腦血管疾病的發(fā)病中起著十分重要的作用[6]，目前缺乏理想的治療藥物。在中醫(yī)理論中，對缺血性腦梗死病因病機的認識有多種學(xué)說，如痰瘀互結(jié)、痰熱腑實、肝風(fēng)內(nèi)動、腎氣虛弱等，但大多數(shù)學(xué)者仍傾向于氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的主要病因病機。也就是說，血液的高黏、高凝、高聚狀態(tài)，血液流變學(xué)指標發(fā)生異常，血液黏度增高、纖維蛋白原顯著增加、紅細胞變形能力降低，是血栓形成導(dǎo)致腦梗死的重要因素[7]。

益氣活血法是治療中風(fēng)病的基本治法，益氣為治本之法，活血為治標之法[8]。益氣使人體氣機充沛，功能正常，氣血調(diào)和，正氣強盛；活血化瘀可使經(jīng)絡(luò)通暢，氣血調(diào)暢，郁火不生，清竅、腦絡(luò)不受蒙蔽。本研究中的通腦溶栓膠囊是由黃芪、粉葛、川芎、桃仁、雞血藤、地龍等中藥材組成的中藥新藥，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效?，F(xiàn)代藥理實驗表明，黃芪使冠狀血管和腎臟血管擴張，并使全身末梢血管擴張，皮膚循環(huán)暢盛，使高血壓患者血壓下降[9]。而葛根的有效成分大豆黃酮等可明顯促進腦、冠脈循環(huán)，改善腎上腺素所致微循環(huán)障礙，并對缺血心肌有保護作用[10]。文獻報道[11],桃仁提取液能明顯增加腦血流量，降低血管阻力，改善血流動力學(xué)狀況，桃仁可使小鼠的出血及凝血時間明顯延長，煎劑對體外血栓有抑制作用。雞血藤有散氣、活血、舒筋、活絡(luò)等功效。研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤生藥水煎醇沉劑可明顯抗血小板聚集[12]。

本研究結(jié)果表明，通腦溶栓膠囊對大鼠實驗性血栓形成有顯著的抑制作用，表明通腦溶栓膠囊能降低活體動物動脈血流中血小板黏附聚集功能；同時，通腦溶栓膠囊對大鼠凝血功能有一定影響，可降低血小板聚集率，明顯延長凝血時間、PT及APTT，對血液流變學(xué)指標也有明顯的改善作用，能顯著降低高分子右旋糖酐所致大鼠血瘀模型的血液黏度，改善血液循環(huán)，從而有效地避免了血栓形成的潛在風(fēng)險，充分體現(xiàn)了通腦溶栓膠囊所具有的活血化瘀、通絡(luò)的功能。但其確切的作用機制有待于進一步的研究。

參考文獻：

[1] 韋國麟，崔明，秦清，等. 復(fù)方銀杏滴丸對大鼠體內(nèi)溶栓作用研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2008, 6(5):15-16.

[2] 吳劍萍，桂玲，李琴，等. 抗血栓片對大鼠血栓形成和血液流變學(xué)的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2008, 28(17):1448-1450.

[3] 方偉，廖詩平，鐘暉，等. 皂角皂苷對大鼠血栓形成及微循環(huán)障礙的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2009, 25(5):76-79.

[4] 覃潔萍，王乃平，鐘正賢，等. 楊梅素分散片對大鼠實驗性腦缺血的保護作用及對血栓形成的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(1):58-60.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2002:1070-1073.

[6] 譚瀅，王磊，周有利，等. 腦梗死患者高壓氧治療前后的血脂及血液流變學(xué)指標分析[J]. 微循環(huán)雜志, 2007, 17(4):55-57.

[7] 趙紅梅，于曉風(fēng)，曲紹春，等. 麝香抗栓丸對實驗性腦缺血大鼠血小板功能及血液黏度的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2004, 30(3):393-395.

[8] 王兵. 益氣活血法治療缺血性中風(fēng)的研究近況[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2007, 9(1):162-163.

[9] 宋錦葉，孟立強，李曉玫. 黃芪與當歸在腎臟微血管病變中的治療應(yīng)用前景[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 28(9):859-861.

[10] 蔡小軍，許惠琴. 葛根注射液對麻醉犬急性心肌缺血的保護作用[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2007, 25(12):2616-2618.

[11] 趙強，李瑩，孔令升，等. 王廷璞桃仁化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J]. 天水師范學(xué)院學(xué)報, 2008, 2(2):56-59.

[12] 怡悅. 雞血藤對血小板聚集的影響[J]. 國外醫(yī)學(xué)：中醫(yī)中藥分冊, 2001, 23(2):85-86.