南方水稻黑條矮縮病毒湖南分離物S9片段ORF序列分析

凌曉曦， 劉 勇，， 張松柏， 匡 煒， 彭 靜， 周灝明， 張德詠，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南省植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

南方水稻黑條矮縮病毒湖南分離物S9片段ORF序列分析

凌曉曦1， 劉 勇1，2， 張松柏2， 匡 煒2， 彭 靜2， 周灝明2， 張德詠1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.湖南省植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

摘要本文克隆了湖南省2011－2013年水稻的15個(gè)SRBSDV分離物S9兩個(gè)基因，并測(cè)定了其核苷酸序列，序列分析與比較表明，S9兩個(gè)ORF序列同源性均大于99.5%。突變位點(diǎn)分析表明，S9編碼的兩個(gè)ORF有3～9個(gè)突變位點(diǎn)，但大部分的核酸突變?yōu)闊o(wú)義突變。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，S9編碼的兩個(gè)ORF高度同源，處于相同的的系統(tǒng)發(fā)育分支。

關(guān)鍵詞南方水稻黑條矮縮病； ORF； S9片段； 序列分析

南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice blackstreaked d warf virus，SRBSDV）于2001年在廣東省陽(yáng)西縣首次發(fā)現(xiàn)［1］，2008年被正式鑒定為呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）第2組的一個(gè)新種［2-3］。2009年，該病在廣東、海南、江西和湖南等省的部分稻區(qū)暴發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，造成約6 500 hm2水稻失收，受害面積達(dá)30萬(wàn)hm2［4］。

SRBSDV的基因組由10條雙鏈RNA（dsRNA）組成，根據(jù)電泳遷移速率從慢到快依次命名為S1～S10。由于SRBSDV是2008年后才被人們熟知和廣泛關(guān)注的新病毒，因此對(duì)其編碼蛋白的功能研究甚少。根據(jù)SRBSDV與RBSDV同屬于斐濟(jì)病毒屬且編碼蛋白的高度同源性，可以推測(cè)SRBSDV編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（P1、P2、P3、P4、P8、P10）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（P5-1、P5-2、P6、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2）；推測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白P1為病毒RNA依賴的RNA聚合酶，P2為病毒內(nèi)核的組分，P3為帽子酶，P4為病毒外殼的B刺突蛋白，P8為病毒的核心衣殼蛋白，P10為病毒主要外層衣殼蛋白，其序列具有保守性，是分類和鑒定病毒屬種的重要依據(jù)［5-9］。目前已有的研究主要針對(duì)SRBSDV編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的功能。最新研究推測(cè)表明P5-1、P6蛋白與病毒原質(zhì)的形成有關(guān)，P7-1蛋白可能參與病毒的擴(kuò)散［10］。

病毒、寄主以及傳毒介體長(zhǎng)期的互作過(guò)程中，均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變，大量研究表明，病毒、寄主和傳播介體，在相互作用過(guò)程中存在協(xié)同進(jìn)化［11］。SRBSDV的S9編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白是提供病毒復(fù)制和裝配場(chǎng)所病毒原質(zhì)（viroplasm）的組分之一［9］，在SRBSDV的增殖過(guò)程中發(fā)揮重要功能。這些基因的進(jìn)化，將影響SRBSDV的復(fù)制，從而影響該病毒的侵染性及寄主適應(yīng)性，在SRBSDV遺傳多樣性的研究中，已有S10的報(bào)道［12-13］。但目前鮮見(jiàn)SRBSDV的S9編碼基因的遺傳多樣性研究報(bào)道。

本文克隆了2011－2013年湖南省不同地區(qū)侵染水稻的SRBSDV的基因組組分9（S9）的兩個(gè)ORF，分析了其突變和遺傳多樣性，為該病害的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻樣品

從湖南省主要水稻產(chǎn)區(qū)采集樣品，－20℃保存。

1.2 總RNA的提取及RT-PCR

水稻總RNA抽提采用TRIzol法，SRBSDV的RT-PCR檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］，檢測(cè)引物為S10-F：5′-CGCGTCATCTCAAAACTACAG-3′，S10-R：5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′，擴(kuò)增片段大小約為700 bp。

1.3 S9的ORF序列克隆與分析

根據(jù)GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／）中SRBSDV S9全序列（EU523359），設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1），擴(kuò)增目標(biāo)片段包含SRBSDV S9的兩個(gè)ORF及間隔區(qū)（圖1）大小分別為1 078 bp和1 272 bp。

圖1 序列克隆引物Fig.1 Primers for cloning the sequences

表1 S9 ORFs克隆引物Table 1 The primers of cloning S9 ORFs of SRBSDV

序列測(cè)定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，利用生物信息學(xué)軟件Mega 4［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV檢測(cè)及S9部分序列克隆

湖南省采集的50個(gè)水稻樣品中，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，共有15個(gè)陽(yáng)性樣品（表2）。以SRBSDV陽(yáng)性水稻樣品總RNA為模板，以設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段采用瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的單一目的條帶。切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，鏈接到T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，序列測(cè)定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。測(cè)定的序列登錄NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／），登錄號(hào)見(jiàn)表2。

表2 SRBSDV陽(yáng)性樣品信息表Table 2 Sequenced rice samples infected by SRBSDV

續(xù)表2 Table2（Continued）

2.2 S9ORF序列分析

2.2.1 突變位點(diǎn)分析

序列聯(lián)配結(jié)果表明，SRBSDV的15個(gè)湖南分離物的S9兩個(gè)ORF核酸序列都具有數(shù)目不一的突變位點(diǎn)，其中以SRBSDV-HuNyz6的突變位點(diǎn)最多，有9個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。推測(cè)蛋白聯(lián)配結(jié)果表明，僅有少量核酸突變位點(diǎn)，導(dǎo)致氨基酸突變。

S9ORF1的核酸序列的轉(zhuǎn)換／顛換率比率為k1＝10.987（嘌呤）和k2＝19.599（嘧啶）。整體轉(zhuǎn)換／顛換偏差為R＝5.454，序列變異偏好A／G或C／T的轉(zhuǎn)換（表3）。S9ORF2的核酸序列的轉(zhuǎn)換／顛換率比率為k1＝9.402（嘌呤）和k2＝17.041（嘧啶）。整體轉(zhuǎn)換／顛換偏差為R＝4.564，序列變異偏好A／G或C／T的轉(zhuǎn)換（表4）。

表3 S9ORF1堿基替換最大可能性分析Table3 Maximumcompositelikelihoodestimate ofthepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF1

表4 S9ORF2堿基替換最大可能性分析Table4 Maximumcompositelikelihoodestimateof thepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF2

2.2.2 核酸遺傳距離分析

利用Mega4軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2，圖3），采用Kimura 2-參數(shù)模型（核酸序列）計(jì)算遺傳距離，繪制序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，S9ORF1的同源性為99.54%，遺傳距離平均值為0.0096±0.0038，S9ORF2的同源性為99.68%，遺傳距離平均值為0.0038±0.0019。

系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，湖南省的15個(gè)SRBSDV分離物S9的兩個(gè)ORF高度同源，處于一個(gè)進(jìn)化分支（圖2，圖3）。

圖2 SRBSDVS9ORF1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 PhylogenetictreeofSRBSDVS9ORF1

圖3 SRBSDV S9 ORF2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of SRBSDV S9 ORF2

3 討論

南方水稻黑條矮縮?。⊿RBSDV）是近年來(lái)在水稻上發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，目前，該病毒的基因組序列、編碼蛋白功能、與寄主互作等都有研究報(bào)道［9，15］，特別是采用高通量測(cè)序技術(shù)及生物學(xué)研究表明，SRBSDV對(duì)傳毒介體［16］具有多方面的影響。這些研究工作為研究SRBSDV遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)和參考。

湖南省2011－2013年水稻的SRBSDV分離物的S9兩個(gè)ORF的序列比較表明，其同源性很高（＞99.5%），大部分的核酸突變?yōu)闊o(wú)義突變，表明S9的兩個(gè)ORF遺傳穩(wěn)定性高。這可能是與其編碼基因的重要功能［11］相關(guān)，這兩個(gè)基因的突變，將導(dǎo)致病毒無(wú)法復(fù)制和裝配。此外，研究表明，由昆蟲(chóng)介體傳播的植物病毒，受介體和寄主的雙重選擇壓力，其進(jìn)化受到相對(duì)較大的限制［17］。湖南省水稻的15個(gè)SRBSDV高度同源，也符合昆蟲(chóng)介體傳播病毒同源性高的特征。

來(lái)自于湖南省不同年份不同地區(qū)的15個(gè)SRBSDV-S9高度同源，與已有文獻(xiàn)報(bào)道的來(lái)自于我國(guó)南方不同稻區(qū)、不同年份水稻的SRBSDVS10［7，12］和SRBSDV-S7-9［2-3，7，12］同源性高的結(jié)果一致，這可能與SRBSDV的源頭有關(guān)。由于SRBSDV僅由白背飛虱傳播［3］，白背飛虱是遷飛性害蟲(chóng)［18］，因此，每年我國(guó)南方的SRBSDV最初源頭都來(lái)源于白背飛虱的越冬區(qū)，因不存在地理隔離等導(dǎo)致的進(jìn)化壓力，故SRBSDV的來(lái)源單一，遺傳多樣性較小。

本研究結(jié)果表明，湖南省不同稻區(qū)與我國(guó)南方其他地區(qū)稻區(qū)的SRBSDV來(lái)源相同，這對(duì)生產(chǎn)上防治此病害具有重要的指導(dǎo)意義。由于毒源來(lái)源單一且為外來(lái)遷入，對(duì)于湖南SRBSDV的防控，最好的辦法是在SRBSDV的毒源地進(jìn)行源頭防控，這需要全國(guó)范圍內(nèi)甚至國(guó)際間的合作。此外，針對(duì)其毒源來(lái)源單一的特點(diǎn)，可主抓病源侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其是在其大量擴(kuò)散時(shí)，于白背飛虱遷入高峰期全力、高效、快速防控遷入的白背飛虱成蟲(chóng)以切斷介體的初始傳毒和毒源的初始侵染，對(duì)于已遷入湖南省等地區(qū)的毒源，可考慮主抓白背飛虱遷入代若蟲(chóng)的防治以切斷毒源的進(jìn)一步擴(kuò)散危害。

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中圖分類號(hào)：S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.025

收稿日期：2013-09-26

修訂日期：2014-03-01

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003031）

*通信作者E-mail：dyzhang78＠gmail.com

Sequence analysis of ORFs of segment 9 of Junan isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus

Ling Xiaoxi1， Liu Yong1，2， Zhang Songbai2， Kuang Wei2， Peng Jing2， Zhou Haoming2， Zhang Deyong1，2
（1.College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Plant Protection Institute，Changsha 410125，China）

AbstractThe full-length sequences of two ORFs of the genome segment 9（S9）of Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）isolates collected in different regions of Hunan Province was cloned and sequenced.The homology between the two ORFs of S9 in 5 isolates was higher than 99.5%.There was 3－9 mutation sites in both ORFs，but most of them were nonsense.The results of phylogenetic analysis showed that both ORFs from different variants shared high level of sequence identity and gathered in the same cluster.

Key wordsSouthern rice black-streaked dwarf virus； ORF； segment 9； sequence analysis