親水相互作用色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜多重碎裂模式在完整糖肽研究中的應(yīng)用

江靜　應(yīng)萬濤錢小紅

摘要 蛋白質(zhì)的糖基化修飾在生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。由于技術(shù)條件的限制，傳統(tǒng)的糖蛋白分析方法中，通常分別鑒定蛋白質(zhì)和糖鏈兩者的結(jié)構(gòu)，而忽略了蛋白質(zhì)與糖鏈的連接關(guān)系。本研究旨在以完整糖肽作為檢測對象，對糖肽中肽段序列和糖鏈結(jié)構(gòu)的同步解析。采用親水相互作用色譜對完整糖肽進(jìn)行分離純化，聯(lián)合生物質(zhì)譜中碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、高能誘導(dǎo)解離（HCD）、電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等裂解模式，對完整糖肽的糖基化位點、糖鏈結(jié)構(gòu)、肽段序列等進(jìn)行全方面的解析。結(jié)果表明，親水相互作用色譜中樣品與填料比1∶50可有效富集糖肽，采用30% CID能量，主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索；采用25% HCD能量，在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息，并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子；ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂，可以提供有效的肽段序列信息。本研究結(jié)合親水相互作用色譜與質(zhì)譜儀中的多種碎裂方式，為完整糖肽的結(jié)構(gòu)解析提供了一種快速、有效的研究方案。

關(guān)鍵詞 親水作用色譜； 串聯(lián)質(zhì)譜； 完整糖肽； 碰撞誘導(dǎo)解離； 高能誘導(dǎo)解離； 電子轉(zhuǎn)移解離

1引言

蛋白質(zhì)的糖基化修飾是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要翻譯后修飾方式[1，2]，但其研究面臨很多挑戰(zhàn)。糖基化修飾具有多樣性。糖基化修飾沒有任何模板[3]，而是由200多種糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控，同一蛋白質(zhì)的不同位點的修飾水平不一，同一位點所攜帶的糖鏈也存在多種結(jié)構(gòu)，這給分析技術(shù)和軟件工具帶來了巨大挑戰(zhàn)；目前完整糖肽的分析手段有限，主要以質(zhì)譜分析為主，但由于糖肽修飾的微不均一性，及在質(zhì)譜中離子化困難、碎裂情況復(fù)雜等特點，嚴(yán)重制約了完整糖肽的富集和質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展。

2012年，Doerr等[4]總結(jié)了糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的經(jīng)典研究手段，并指出主要的研究方法是先將糖鏈從蛋白上釋放，然后分別對兩者進(jìn)行解析，這導(dǎo)致了蛋白與糖鏈之間聯(lián)系的缺失。聚糖結(jié)構(gòu)解析[5]，可以解析大量糖鏈結(jié)構(gòu)，卻忽視了糖鏈的來源；蛋白部分研究[6]，可以得到明確的蛋白序列及大規(guī)模糖基化位點，卻丟失了糖鏈信息。Nakano等[7]研究發(fā)現(xiàn)，特異位點的糖基化修飾影響生物學(xué)功能，這表明位點特異性水平的糖基化修飾研究對進(jìn)一步闡釋糖蛋白質(zhì)的生理功能及其在病理過程中的變化具有重要意義。因此，開發(fā)完整糖肽水平的研究方法，保留蛋白質(zhì)與聚糖之間的連接，已成為當(dāng)前的研究熱點。

完整糖肽的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對分析方法的制約，需要從富集和鑒定兩方面解決。首先是由不均一性導(dǎo)致的糖肽低化學(xué)計量水平，及其在質(zhì)譜中離子化效率不高而受非糖肽信號抑制的問題?？梢酝ㄟ^完整糖肽的富集與分離，去除非糖肽的干擾而提高糖肽的相對豐度。目前應(yīng)用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]、二氧化鈦[9]、酰肼[10]和親水相互作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[11]等。其中，HILIC是基于富含多羥基的糖鏈結(jié)構(gòu)的強(qiáng)親水特性，而使糖肽與非糖基化肽段得以分離。HILIC對不同類型的糖肽沒有偏性，且能保持糖鏈結(jié)構(gòu)的完整性，適合作為完整糖肽結(jié)構(gòu)研究中的富集技術(shù)。其次，完整糖肽包含肽段和糖鏈兩部分，其結(jié)構(gòu)和連接方式的差異導(dǎo)致兩者在串聯(lián)質(zhì)譜中的碎裂行為有較大的區(qū)別，僅采用經(jīng)典的碰撞誘導(dǎo)解離（Collisioninduced dissociation， CID）碎裂不能有效得到糖肽的全面信息，Wiesner等[12]指出， 電子轉(zhuǎn)移解離（Electron transfer dissociation， ETD）碎裂模式在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中， 可以補充CID的不足而發(fā)揮重要作用，高能誘導(dǎo)解離（High energy collisional dissociation， HCD）可以提供更為豐富的低分子段碎片離子信息。多種碎裂方式聯(lián)合的方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中也已經(jīng)得到有效應(yīng)用[13]，多種碎裂方式聯(lián)合應(yīng)用的方式可以為完整糖肽研究提供借鑒。

本研究以完整糖肽作為檢測對象，制作了HILIC富集裝置，并聯(lián)合CID， HCD， ETD等多種串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式，在解析糖鏈結(jié)構(gòu)的同時，獲取肽段序列以及糖基化位點信息，從而實現(xiàn)糖蛋白結(jié)構(gòu)的全面解析。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀 （UltrafleXtremeMALDITOF/TOFMS， 德國 Bruker Daltonics公司）； 電噴霧電離線性離子阱靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（ESILTQOrbitrapXL， 美國Thermo Fisher 公司）；離心機(jī)、冷凍干燥離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；HILIC 小柱（自制，親水相互作用填料為博納艾杰爾科技產(chǎn)品）。

牛胎球蛋白（Fetuin）、核糖核酸酶B （RNase B）、2，5二羥基苯甲酸（DHB）、乙腈（美國Sigma公司）；肽N糖苷酶F （PNGase F， NEB公司）； 胰酶Trypsin（測序級， 美國Promega公司）； 二硫蘇糖醇（DTT， 美國GE公司），碘乙酰胺（IAA， 比利時Acros公司），三氟乙酸（TFA）、甲酸（美國Fluka公司）； 其它試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為MilliQ制備的超純水。

2.2實驗方法

2.2.1糖蛋白酶解取適量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白，溶解于50 mmol/L NH4HCO3。加入適量DTT，使終濃度為10 mmol/L，56 ℃水浴1 h。加入IAA，使其終濃度為40 mmol/L，暗處反應(yīng)30 min。 加入終濃度為10 mmol/L DTT封閉過量的IAA。按質(zhì)量比1∶50加入胰酶進(jìn)行酶切，37 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)溶液置于95 ℃水浴10 min，滅活胰酶，終止酶解反應(yīng)。

2.2.2HILIC小柱富集完整糖肽本實驗使用由移液槍頭自制的HILIC小柱富集純化蛋白酶切混合物中的糖肽。首先，用80%乙腈，1%FA，沖洗活化小柱，然后，濃縮的酶切混合物，溶于50 μL 80%乙腈，1%FA溶液，上樣于HILIC小柱。再用100 μL 80%乙腈，1% FA溶液進(jìn)行脫鹽，重復(fù)3次。最后用5%乙腈，1%FA溶液100 μL洗脫，收集糖肽。洗脫溶液用冷凍干燥離心機(jī)旋干，

Symbolm@@ 20 ℃保存待用。

2.2.3MALDITOF/TOFMS分析條件肽段或富集后的糖肽與DHB（2，5二羥基苯甲酸）基質(zhì)1∶1混合點靶。采用正離子反射模式，離子源電壓20 kV，脈沖離子提取電壓18.8 kV，離子提取延時時間110 ns，激光頻率2000 Hz，激光能量50%，每張譜圖共采集1500個激光點，校準(zhǔn)相對誤差≤5 ppm。分析質(zhì)譜圖譜的軟件為FlexAnalysis 3.4。

2.2.4ESILTQOrbitrapXL分析條件HILIC小柱富集純化得到的完整糖肽樣品，溶解于50%乙腈0.1%甲酸溶液中，用納升級電噴霧離子源直接進(jìn)樣，采用LTQOrbitrapXL質(zhì)譜儀，正離子模式下掃描。采用碰撞誘導(dǎo)解離（CID）；高能誘導(dǎo)解離（HCD）；電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等不同的碎裂方式進(jìn)行碎裂，然后由Orbitrap進(jìn)行檢測。

3結(jié)果與討論

3.1親水相互作用色譜富集完整糖肽

3.1.1HILIC富集糖肽方法考察本研究采用牛胎球蛋白優(yōu)化HILIC小柱富集步驟。牛胎球蛋白由Trypsin酶切后，經(jīng)PNGase F處理去除糖肽上的糖鏈，未經(jīng)富集的Fetuin蛋白酶切產(chǎn)物如圖1a所示。PNGase F去除糖鏈后，消除了糖鏈不均一性對質(zhì)譜的影響，但由于樣品體系的復(fù)雜性和肽段性質(zhì)的差異，去糖后的糖肽在蛋白的總酶切肽段中的相對信號依然較弱。非糖基化肽段形成的分子離子峰1474.84對其它肽段產(chǎn)生了明顯抑制（圖1a）。例如，去糖后N99位的肽段[M+H]+ m/z 3672.7519，及N156位的肽段[M+H]+ m/z 1741.8247，在譜圖中僅為依稀可見的兩個小峰，而N176位的肽段[M+H]+ m/z 3017.5538甚至難以在譜圖中顯現(xiàn)。

基于糖肽中糖鏈部分的親水性，以HILIC填料制作的富集小柱可以用于富集并分離樣品中的完整糖肽。蛋白質(zhì)酶切混合物在高有機(jī)相溶液中上樣，糖肽借助其糖鏈部分富含的羥基等親水基團(tuán)而保留在填料表面的水化層中，而疏水性較強(qiáng)的非糖基化肽段在流動相中分配系數(shù)更大而不在小柱上保留。繼續(xù)用高有機(jī)相溶液充分清洗材料上的非特異性吸附后，由高水相溶液洗脫并收集糖肽。這種基于分配機(jī)制分離的色譜方法，選擇合適有機(jī)溶劑含量的流動相，可以減少材料的非特異性吸附，提高富集效率。圖1b 采用20%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽，圖1c 采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽，由PNGase F處理富集后產(chǎn)物，經(jīng)MALDITOF質(zhì)譜檢測。圖中可見，兩者都可以有效的富集Fetuin的3個N糖基化肽段。但在20%乙腈洗脫時， m/z 1500～2500區(qū)域內(nèi)有較多非糖肽的雜峰，而在5%乙腈洗脫時，該區(qū)域中非特異性吸附引入的干擾明顯減少。結(jié)果表明，采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽可以進(jìn)一步去除非糖肽的干擾，獲得更好的糖肽富集效果。

采用移液器槍頭作為HILIC填料的載體，可以根據(jù)目標(biāo)樣品的多少自由選擇合適量的HILIC填料。合適的填料與樣品比例，可以保證較好的富集效果，減少吸附損失的影響，也可以防止樣品過載。固定填料的用量，依次提高蛋白質(zhì)的上樣量，即選取樣品與填料質(zhì)量比為1∶1000，1∶500，1∶50，1∶10時對Fetuin蛋白的酶切產(chǎn)物進(jìn)行富集。對在洗脫組分和上樣流出組分的糖肽信號進(jìn)行分析，以3個糖肽中信號強(qiáng)度最高的N156位糖肽的去除糖鏈后肽段[M+H]+ m/z 1741.8247（序列為LCPDCPLLAPLNDSR）的相對強(qiáng)度作為參照，結(jié)果如圖2所示。在樣品與填料質(zhì)量比為1∶10，結(jié)合組分和流出組分中的糖肽信號都最高，[TS（][HT5”SS]圖2不同HILIC填料與糖蛋白樣品的比例對富集效果的影響

Fig.2Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material

1. 洗脫組分（Elution）； 2. 流出組分（Flow through）。[HT5][TS）]因此以該條件下的糖肽信號為100%，分別計算其它條件下結(jié)合組分和流出組分中的糖肽相對強(qiáng)度。當(dāng)選取樣品與填料質(zhì)量比為1∶1000和1∶500時，雖然流出組分中未結(jié)合的糖肽比例低于20%，但洗脫組分中的糖肽信號也小于40%。當(dāng)樣品與填料質(zhì)量比為1∶50時，結(jié)合組分中糖肽得到有效的富集，而流出組分中糖肽信號仍低于20%。樣品與填料比例為1∶10時，上樣流出組分中的糖肽相對信號大幅增加，表明此時糖肽已經(jīng)過載。因此，在制作HILIC小柱時，采用樣品與填料質(zhì)量比為1∶50時富集效果顯著，并能得到較好的回收率。

3.1.2RNase B完整糖肽制備與純化RNase B經(jīng)過Trypsin酶切，在DHB基質(zhì)輔助下，得到糖肽和肽段混合物的一級質(zhì)譜圖，如圖3a所示。由于糖基化的微不均一性，核糖核苷酶B的同一糖基化位點含有5個不同糖鏈長度的高甘露糖（Mannose， Man），即在化學(xué)計量水平，一個肽段的豐度被分散到5個糖肽上。對于相對含量較低的糖型，受到其它肽段的干擾更為嚴(yán)重，而不利于質(zhì)譜的選擇與檢測。經(jīng)過HILIC小柱富集后，酶切產(chǎn)物中的非糖基化肽段被有效的去除，僅留下5個清晰的糖肽（圖3b），為肽段序列SRNLTK上分別連接Man5，Man6，Man7，Man8，Man9等不同長度的高甘露糖糖鏈。

3.2多重碎裂方式互補，全面解析完整糖肽

3.2.1完整糖肽在經(jīng)典CID模式下的碎裂碰撞誘導(dǎo)解離（CID）是生物質(zhì)譜中肽段序列分析最為常用的碎裂模式，肽段活化碰撞后主要產(chǎn)生b、y系碎片離子而得以解析序列。但糖基化修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)分子量較大，在CID的能量碰撞下，糖肽不能充分碎裂。以肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽為例，其在電噴霧離子源中雙電荷離子為[M+2H]2+ m/z 967.93。由于糖苷鍵穩(wěn)定性比酰胺鍵弱，在CID條件下優(yōu)先斷裂，而形成糖肽上逐一丟失單糖的二級碎裂圖譜。改變CID的碎裂能量，從10%至50%。當(dāng)CID 能量為20%，糖肽母離子開始碎裂，其最強(qiáng)的子離子占母離子相對豐度的70%，當(dāng)CID能量為30%時， 母離子全部碎裂（圖4）。繼續(xù)提高能量至35%，40%，45%和50%， 其碎裂情況基本不變。因此，CID的碎裂譜圖上難以得到肽段序列的信息，不能全面闡明完整糖肽的結(jié)構(gòu)。

[TS（][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄糖胺，圓圈為甘露糖）

Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]

3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下，累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞，碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽，m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時，糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域，產(chǎn)生系列糖的特征離子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓離子m/z 204（HexNAc+H）+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失，使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域，HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子，各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài)，故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高，因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

[TS（][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄，圓圈為甘露糖）。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]

由圖6可見，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加，糖的特征碎片離子信號不斷升高，其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時，雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%～25%的中高能量下信號較高，隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng)，雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列，在HCD能量25%時達(dá)到高峰，但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%，對糖肽進(jìn)行碰撞解離，其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS（][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下，糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度： （a） 糖的特征離子；（b）雙電荷的Y系列離子；（c）1電荷的Y系列離子

Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]

3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上，從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式，翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留，因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中，產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子，從C3～C5及Z4～Z6兩組離子中，得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2～C3及Z3～Z4之間，有大范圍的質(zhì)量跳躍，可以清晰指示糖基化位點。

綜上所述，CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索；HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息，并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子，同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考；ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式，即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

4結(jié)論

本研究從解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此，本方法在有效富集糖肽的同時，獲取了肽段序列以及糖基化位點信息，并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu)，為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜，且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫，規(guī)?；请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難，但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展，親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。

[TS（][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄糖胺，圓圈為甘露糖）

Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]

3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下，累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞，碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽，m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時，糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域，產(chǎn)生系列糖的特征離子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓離子m/z 204（HexNAc+H）+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失，使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域，HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子，各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài)，故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高，因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

[TS（][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄，圓圈為甘露糖）。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]

由圖6可見，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加，糖的特征碎片離子信號不斷升高，其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時，雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%～25%的中高能量下信號較高，隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng)，雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列，在HCD能量25%時達(dá)到高峰，但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%，對糖肽進(jìn)行碰撞解離，其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS（][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下，糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度： （a） 糖的特征離子；（b）雙電荷的Y系列離子；（c）1電荷的Y系列離子

Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]

3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上，從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式，翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留，因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中，產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子，從C3～C5及Z4～Z6兩組離子中，得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2～C3及Z3～Z4之間，有大范圍的質(zhì)量跳躍，可以清晰指示糖基化位點。

綜上所述，CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索；HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息，并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子，同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考；ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式，即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

4結(jié)論

本研究從解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此，本方法在有效富集糖肽的同時，獲取了肽段序列以及糖基化位點信息，并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu)，為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜，且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫，規(guī)?；请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難，但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展，親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。

[TS（][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄糖胺，圓圈為甘露糖）

Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]

3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下，累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞，碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽，m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時，糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域，產(chǎn)生系列糖的特征離子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓離子m/z 204（HexNAc+H）+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失，使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域，HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子，各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài)，故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高，因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

[TS（][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖（方塊為N乙酰葡萄，圓圈為甘露糖）。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]

由圖6可見，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加，糖的特征碎片離子信號不斷升高，其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時，雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%～25%的中高能量下信號較高，隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng)，雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列，在HCD能量25%時達(dá)到高峰，但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%，對糖肽進(jìn)行碰撞解離，其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS（][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下，糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度： （a） 糖的特征離子；（b）雙電荷的Y系列離子；（c）1電荷的Y系列離子

Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]

3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上，從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式，翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留，因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中，產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子，從C3～C5及Z4～Z6兩組離子中，得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2～C3及Z3～Z4之間，有大范圍的質(zhì)量跳躍，可以清晰指示糖基化位點。

綜上所述，CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索；HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息，并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子，同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片，為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考；ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式，即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

4結(jié)論

本研究從解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測，聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此，本方法在有效富集糖肽的同時，獲取了肽段序列以及糖基化位點信息，并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu)，為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜，且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫，規(guī)?；请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難，但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展，親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。