高效液相色譜法鑒別及測(cè)定中藥吳茱萸中的生物胺

孫艷妮　張寧等

摘 要 建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑，采用島津高效液相色譜儀（LC10A），色譜柱SHIMADZUC18 （150 mm × 4.6 mm× 5 μm）進(jìn)行測(cè)定， 確定了最佳色譜條件：乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗脫，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離，在給定的濃度范圍內(nèi)，各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2>0.999），精密度RSD<2%，回收率在91.87%～101.35%之間，重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明，吳茱萸葉中含有7種生物胺，枝中含有4種，果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

關(guān)鍵詞 生物胺； 吳茱萸；衍生化分析； 高效液相色譜

1 引 言

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.officinalis （Dode） Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?，F(xiàn)代藥理研究表明， 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2，3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種，其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種，其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的，即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此，在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的，可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí)，其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類：脂肪族，包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等，它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分，在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用；芳香族，包括酪胺、苯乙胺等；雜環(huán)胺，包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用，對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用；多胺主要包括精胺和亞精胺，其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體（包括人體）內(nèi)的正?；钚猿煞郑谏锛?xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng)，它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn)，因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光，因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯（Dansylchloride）[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰（Dabsyl chloride）[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍，生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定， 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收，既可以用熒光檢測(cè)，也可以用紫外檢測(cè)[9]，生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下：

HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法，簡(jiǎn)單有效。為此，本研究以丹磺酰氯為衍生試劑，衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集，適用于測(cè)定成分復(fù)雜，生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC10A），配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器； SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm × 5μm）；Milli Q Biocel超純水機(jī)（美國(guó)MilliPoreco公司）；移液槍（德國(guó) Eppendorf公司）；粉碎機(jī)（黃驊市中興儀器有限公司）；SHAC恒溫振蕩器（國(guó)華企業(yè)）；Anke TDL40B離心機(jī)（Anke公司），F(xiàn)ilter Unit濾膜（0.45 μm）。

乙腈 （色譜純）；丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯（分析純）；甲胺，色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，組胺，5羥色胺，酪胺，亞精胺，精胺，均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，

吳茱萸樣品：果、葉、枝采自西安植物園，經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

2.2 色譜條件

SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm× 5μm）； 檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm； 流速：0.8 mL/min； 進(jìn)樣量：20 μL； 柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：水（A）乙腈（B），采用梯度洗脫：0～7 min，45%～50% B； 7～25 min，50%～90% B； 25～35 min，90% B； 35～40 min，90%～45% B； 40～45 min，45% B。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用0.1 mol/L HCl溶解，定容至10 mL， 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

衍生化試劑：精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮，置于10 mL棕色容量瓶中，加入丙酮定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品的制備

吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重，粉碎，過(guò)50目篩（粒徑0.36 mm）。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中， 加入30 mL 1 mol/L HCl，振蕩提取1 h，過(guò)濾上清液（提取3次，后兩次每次15 mL），合并濾液，4000 r/min離心8 min，上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管，用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12，加入正丁醇二氯甲烷（1 ∶ 1， V/V），渦旋1 min，4000 r/min離心8 min，萃取3次，每次10 mL，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1 mol/L HCl溶解，取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶，進(jìn)行衍生化分析； 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶，作為空白對(duì)照。

0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液，加入1 mL NaHCO3/Na2CO3（pH 10.5），0.5 mL丹磺酰氯，在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?；靹蚝?，60 ℃水浴45 min，加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯，停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后，以乙腈定容至5 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取與衍生化

采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺，結(jié)果見表1，綜合比較，HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為： 0.5 mL丹磺酰氯（5 g/L），60 ℃水浴45 min。

3.2 色譜條件的選擇

在190～800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描，最大吸收峰為251 nm，在334 nm處也有吸收，但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大，因此選取334 nm。

流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要，本實(shí)驗(yàn)采用水（A）乙腈（B）為流動(dòng)相， 梯度洗脫：

摘 要 建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑，采用島津高效液相色譜儀（LC10A），色譜柱SHIMADZUC18 （150 mm × 4.6 mm× 5 μm）進(jìn)行測(cè)定， 確定了最佳色譜條件：乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗脫，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離，在給定的濃度范圍內(nèi)，各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2>0.999），精密度RSD<2%，回收率在91.87%～101.35%之間，重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明，吳茱萸葉中含有7種生物胺，枝中含有4種，果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

關(guān)鍵詞 生物胺； 吳茱萸；衍生化分析； 高效液相色譜

1 引 言

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.officinalis （Dode） Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?，F(xiàn)代藥理研究表明， 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2，3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種，其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種，其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的，即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此，在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的，可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí)，其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類：脂肪族，包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等，它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分，在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用；芳香族，包括酪胺、苯乙胺等；雜環(huán)胺，包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用，對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用；多胺主要包括精胺和亞精胺，其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體（包括人體）內(nèi)的正?；钚猿煞?，在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng)，它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn)，因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光，因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯（Dansylchloride）[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰（Dabsyl chloride）[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍，生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定， 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收，既可以用熒光檢測(cè)，也可以用紫外檢測(cè)[9]，生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下：

HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法，簡(jiǎn)單有效。為此，本研究以丹磺酰氯為衍生試劑，衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集，適用于測(cè)定成分復(fù)雜，生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC10A），配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器； SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm × 5μm）；Milli Q Biocel超純水機(jī)（美國(guó)MilliPoreco公司）；移液槍（德國(guó) Eppendorf公司）；粉碎機(jī)（黃驊市中興儀器有限公司）；SHAC恒溫振蕩器（國(guó)華企業(yè)）；Anke TDL40B離心機(jī)（Anke公司），F(xiàn)ilter Unit濾膜（0.45 μm）。

乙腈 （色譜純）；丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯（分析純）；甲胺，色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，組胺，5羥色胺，酪胺，亞精胺，精胺，均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，

吳茱萸樣品：果、葉、枝采自西安植物園，經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

2.2 色譜條件

SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm× 5μm）； 檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm； 流速：0.8 mL/min； 進(jìn)樣量：20 μL； 柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：水（A）乙腈（B），采用梯度洗脫：0～7 min，45%～50% B； 7～25 min，50%～90% B； 25～35 min，90% B； 35～40 min，90%～45% B； 40～45 min，45% B。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用0.1 mol/L HCl溶解，定容至10 mL， 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

衍生化試劑：精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮，置于10 mL棕色容量瓶中，加入丙酮定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品的制備

吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重，粉碎，過(guò)50目篩（粒徑0.36 mm）。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中， 加入30 mL 1 mol/L HCl，振蕩提取1 h，過(guò)濾上清液（提取3次，后兩次每次15 mL），合并濾液，4000 r/min離心8 min，上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管，用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12，加入正丁醇二氯甲烷（1 ∶ 1， V/V），渦旋1 min，4000 r/min離心8 min，萃取3次，每次10 mL，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1 mol/L HCl溶解，取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶，進(jìn)行衍生化分析； 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶，作為空白對(duì)照。

0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液，加入1 mL NaHCO3/Na2CO3（pH 10.5），0.5 mL丹磺酰氯，在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?；靹蚝螅?0 ℃水浴45 min，加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯，停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后，以乙腈定容至5 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取與衍生化

采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺，結(jié)果見表1，綜合比較，HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為： 0.5 mL丹磺酰氯（5 g/L），60 ℃水浴45 min。

3.2 色譜條件的選擇

在190～800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描，最大吸收峰為251 nm，在334 nm處也有吸收，但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大，因此選取334 nm。

流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要，本實(shí)驗(yàn)采用水（A）乙腈（B）為流動(dòng)相， 梯度洗脫：

摘 要 建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑，采用島津高效液相色譜儀（LC10A），色譜柱SHIMADZUC18 （150 mm × 4.6 mm× 5 μm）進(jìn)行測(cè)定， 確定了最佳色譜條件：乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗脫，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離，在給定的濃度范圍內(nèi)，各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2>0.999），精密度RSD<2%，回收率在91.87%～101.35%之間，重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明，吳茱萸葉中含有7種生物胺，枝中含有4種，果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

關(guān)鍵詞 生物胺； 吳茱萸；衍生化分析； 高效液相色譜

1 引 言

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.officinalis （Dode） Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?，F(xiàn)代藥理研究表明， 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2，3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種，其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種，其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的，即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此，在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的，可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí)，其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類：脂肪族，包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等，它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分，在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用；芳香族，包括酪胺、苯乙胺等；雜環(huán)胺，包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用，對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用；多胺主要包括精胺和亞精胺，其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體（包括人體）內(nèi)的正常活性成分，在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng)，它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn)，因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光，因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯（Dansylchloride）[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰（Dabsyl chloride）[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍，生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定， 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收，既可以用熒光檢測(cè)，也可以用紫外檢測(cè)[9]，生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下：

HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法，簡(jiǎn)單有效。為此，本研究以丹磺酰氯為衍生試劑，衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集，適用于測(cè)定成分復(fù)雜，生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC10A），配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器； SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm × 5μm）；Milli Q Biocel超純水機(jī)（美國(guó)MilliPoreco公司）；移液槍（德國(guó) Eppendorf公司）；粉碎機(jī)（黃驊市中興儀器有限公司）；SHAC恒溫振蕩器（國(guó)華企業(yè)）；Anke TDL40B離心機(jī)（Anke公司），F(xiàn)ilter Unit濾膜（0.45 μm）。

乙腈 （色譜純）；丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯（分析純）；甲胺，色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，組胺，5羥色胺，酪胺，亞精胺，精胺，均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，

吳茱萸樣品：果、葉、枝采自西安植物園，經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

2.2 色譜條件

SHIMADZUC18色譜柱（150 mm × 4.6 mm× 5μm）； 檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm； 流速：0.8 mL/min； 進(jìn)樣量：20 μL； 柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：水（A）乙腈（B），采用梯度洗脫：0～7 min，45%～50% B； 7～25 min，50%～90% B； 25～35 min，90% B； 35～40 min，90%～45% B； 40～45 min，45% B。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用0.1 mol/L HCl溶解，定容至10 mL， 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

衍生化試劑：精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮，置于10 mL棕色容量瓶中，加入丙酮定容，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品的制備

吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重，粉碎，過(guò)50目篩（粒徑0.36 mm）。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中， 加入30 mL 1 mol/L HCl，振蕩提取1 h，過(guò)濾上清液（提取3次，后兩次每次15 mL），合并濾液，4000 r/min離心8 min，上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管，用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12，加入正丁醇二氯甲烷（1 ∶ 1， V/V），渦旋1 min，4000 r/min離心8 min，萃取3次，每次10 mL，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈桑? mL 0.1 mol/L HCl溶解，取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶，進(jìn)行衍生化分析； 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶，作為空白對(duì)照。

0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液，加入1 mL NaHCO3/Na2CO3（pH 10.5），0.5 mL丹磺酰氯，在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?；靹蚝?，60 ℃水浴45 min，加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯，停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后，以乙腈定容至5 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取與衍生化

采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺，結(jié)果見表1，綜合比較，HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為： 0.5 mL丹磺酰氯（5 g/L），60 ℃水浴45 min。

3.2 色譜條件的選擇

在190～800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描，最大吸收峰為251 nm，在334 nm處也有吸收，但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大，因此選取334 nm。

流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要，本實(shí)驗(yàn)采用水（A）乙腈（B）為流動(dòng)相， 梯度洗脫：