在線凝膠滲透色譜—氣相色譜—串聯質譜聯用檢測煙葉中的農藥殘留

羅彥波等

摘 要 采用改進QuEChERS方法，以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/磁性四氧化三鐵復合材料為吸附劑，對煙葉提取物進行凈化，結合在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜聯用儀，建立了煙葉中10種農藥殘留的檢測方法。優(yōu)化了影響實驗結果的參數，最終凝膠滲透色譜在線收集時間選取為3.30～5.30 min、磁性吸附劑用量為80 mg、凈化時間為1.0 min。目標物的檢出限在0.940～100 ng/L之間，線性相關系數R2≥0.9989，日內和日間相對標準偏差分別小于15.1%和19.8%，實際樣品的加標回收率為68.8%～132.2%。本方法成功應用于實際煙葉樣品的檢測，檢測結果與現行標準方法相吻合。

關鍵詞 QuEChERS方法； 在線； 凝膠滲透色譜； 氣相色譜-串聯質譜； 煙葉； 農藥殘留

1 引 言

為了防治病蟲害，煙草在育種、種植、調制和保存期間要使用農藥。殘留農藥會降低煙葉質量，加劇環(huán)境污染， 并威脅人類和其它生物的健康[1]。因此，煙葉中的農藥殘留檢測對保證煙葉質量和環(huán)境安全具有重要意義。由于煙葉樣品基質復雜，其中殘留農藥含量低（低至ng/g級），因此通常需要樣品預處理過程才能進行后續(xù)測定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于煙葉中農藥殘留測定。這些方法存在有機溶劑消耗量大、操作繁冗費時、回收率低等不足。Anastassiades等[6]開發(fā)了“快速、簡便、經濟、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的樣品前處理技術。QuEChERS方法具有回收率高、穩(wěn)定性強和被分析目標物范圍廣等優(yōu)點，因此在農藥殘留檢測中廣泛應用[3]。常規(guī)QuEChERS方法在凈化步驟中通過離心或過濾將吸附劑與樣品液分離，耗時費力。為了克服這一缺陷，本研究組以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/四氯化三鐵（GCB/PSA/Fe3O4）復合材料為吸附劑，改進了QuEChERS方法[7]，吸附劑可以在磁場作用下與提取液快速分離，具有操作簡單、快速高效的優(yōu)點。

在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質譜（GPC-GC-MS）是將凝膠滲透色譜和氣相色譜-質譜在線聯用的分析檢測技術，不但具有抗基質干擾能力強、靈敏度高的優(yōu)點，而且可以連續(xù)自動分析，能提高分析速度和結果的準確性，已被應用于農藥殘留檢測[8～10]。本研究采用改進QuEChERS方法對煙葉樣品前處理，以在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜（GPC-GC-MS/MS）檢測，選取煙草種植生產中對煙葉質量和煙草制品產品安全有影響的常用10種除草劑、抑芽劑和殺蟲劑為代表性化合物，建立了煙葉中農藥殘留量的快速、準確、靈敏分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)（日本島津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A3R脫氣機和SPD-20A紫外檢測器；GC-MS/MS包括日本島津2010-plus氣相色譜和TQ 8030三重四級桿質譜，由FCV-12AH電磁閥實現GPC和GC-MS/MS的在線連接。用Quanta 200 掃描電鏡（Quanta 200，FEI，Holland）對材料形貌進行表征。

環(huán)己烷和丙酮（色譜純，韓國德山純化工有限公司）。所用水由Milli-Q系統(tǒng)（Milford， MA， USA）制得。10種目標物和內標（磷酸三苯酯）均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要時添加丙酮或甲醇）為溶劑配制目標物母液（100 μg/mL）。混合標準工作溶液（內標濃度為20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶劑熱方法制備Fe3O4[7]：在200 mL反應釜內將5.0 g FeCl3·6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并攪拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，攪拌30 min，將反應釜于200℃下反應8 h。待反應釜降溫后，用水和乙醇清洗產物， 60℃下干燥，備用。制備磁性吸附劑時，將0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具蓋玻璃瓶內，用5 mL乙腈清洗3次后，將產物在60℃下干燥即可。

2.2 儀器條件

GPC條件：色譜柱為Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱溫為40℃；流動相為環(huán)己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；進樣量10 μL；GPC收集時間為3.30～5.30 min；GC-MS/MS條件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；預柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分離柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱溫箱程序：初始溫度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流進樣，進樣時間7.0 min；高純He為載氣，壓力程序：由120 kPa開始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢復至原始壓力，保持33.8 min；程序升溫進樣口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和離子源溫度為300℃和200℃；電離源為EI源；電離電壓70 eV；溶劑延遲時間15 min；目標物及內標的多反應監(jiān)測（MRM）參數如表1所示，碰撞氣為Ar，壓力200 kPa。

2.3 樣品制備

本研究建立煙葉提取液快速凈化和檢測的方法，因此直接采用文獻＼[2＼]報道的方法提取煙葉： 稱取2.00 g 煙葉于離心管中，加入10 mL水浸潤樣品；靜置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 內標溶液，振蕩2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 無水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉，振蕩2 min后離心5 min，收集上層提取液；提取液的凈化和檢測方法為：取0.5 mL提取液到裝有磁性吸附劑的離心管中，振蕩1 min；在磁場下將磁性吸附劑與溶液分離，所得溶液為待測液，可進行在線GPC-GC-MS/MS分析。將不含目標物的凈化液濃縮吹干，再加入相同體積、不同濃度的系列標準工作溶液，混勻溶解即得到基質匹配標準曲線。

3 結果與討論

3.1 磁性吸附劑的表征

如圖1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附劑中PSA表面粗糙（圖1b），且在PSA顆粒之間也有材料均勻分布，觀察是GCB和Fe3O4顆粒（圖1c）。Fe3O4能使吸附劑在磁場作用下與樣品溶液快速分離，同時PSA和GCB能分離提取液中的雜質。

3.2 GPC收集時間考察

圖2為在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)的示意圖。其原理為：樣品經GPC柱分離，廢液直接排出系統(tǒng)，含有目標物的餾分先被儲存在定量環(huán)（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的樣品通過打開溶劑蒸氣出口實現溶劑的排出，同時目標分析物在保留在預柱中。待溶劑排出口關閉后柱，溫箱開始升溫，目標物進入分析柱分離。因此選擇收集時間顯得尤為重要。目標物的分子量在溴氰菊酯和滅螨蜢之間，因此目標物在GPC上的保留時間也介于二者之間，二者在GPC上的保留時間為3.50和5.08 min?？紤]靈敏度和基質去除效果，確定收集時間為3.30～5.30 min。

3.3 改進QuEChERS方法的優(yōu)化

為了得到較好的凈化效果，優(yōu)化了磁性吸附劑的用量和凈化時間（GCB、PSA和Fe3O4之間的質量比為4∶5∶10）。如圖3a所示，隨著吸附劑用量增加，提取液的顏色由黃色逐漸變?yōu)榻鼰o色，當吸附劑用量達到80 mg時，繼續(xù)增加用量對凈化效果改善不大。且在考察的范圍內，各目標物的峰面積沒有變化，這可能是因為在煙葉提取液中含有甲苯，使吸附劑與含苯環(huán)目標物之間的相互作用力減弱而引起的?？紤]凈化效果和吸附劑用量，將吸附劑的用量定為80 mg。在0.5～6.0 min范圍內，凈化時間對凈化效果影響不大，且目標物的峰面積沒有變化，這是因為吸附劑在凈化時是分散的，可以使吸附快速達到平衡，因此凈化時間對凈化效果沒有太大影響。為了穩(wěn)定凈化效果，凈化時間選取1.0 min。

比較了本方法與常規(guī)QuEChERS方法的凈化效果，如圖3b所示，未經凈化的煙葉提取液顏色為黃色，經過常規(guī)QuEChERS方法凈化后，提取液顏色變淺；經過本方法凈化后，提取液幾乎無色（Ⅲ）。因此，本方法對色素等雜質的去除效果較好。

3.4 方法確認

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限、定量限、線性范圍和重現性。檢出限和定量限為目標物信噪比為3和10時對應的濃度。以目標物濃度及其與內標峰面積之比為橫、縱坐標，繪制工作曲線。如表2所示，10種目標物的檢出限在0.94～100 ng/L之間，定量限在3.1～34 ng/L之間，線性相關系數R2≥0.9989。本方法提取煙葉的結果與標準方法[11]相同，其中9種目標物（甲氰菊酯除外）的檢出限為40～600 ng/L。本方法能顯著提高靈敏度，是由吸附劑降低基質干擾和在線GPC-GC-MS/MS提高進樣量引起的。

為了考察本方法的重現性，配制3種濃度（各目標物線性范圍最低值的2、10和100倍）的樣品，以一天內配制的4個樣品和連續(xù)3天配制的樣品進行分析，計算日內和日間相對標準偏差。如表3所示，目標物的日內及日間精密度分別小于15.1%和19.8%，其中目標物在中濃度和高濃度下的日內及日間精密度數值不高于8.5%，低濃度下的日內及日間精密度數值相對較高，這可能是由于測定誤差引起的。美國分析化學家學會（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度數值隨著分析物的濃度或含量降低而升高。本研究中目標物在低濃度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度數值低于21%（目標物濃度為10 μg/L時所能接受的精密度數值），說明本方法的重現性可以接受。

3.5 實際樣品分析

為了證明本方法在實際樣品中應用的效果，采用本方法和現行標準方法[11]處理3種煙葉樣品并進行測定。在樣品A中測到了七氟菊酯、二甲戊靈和聯苯菊酯，采用本方法和標準方法均無法對其進行定量分析；在樣品B中測到了七氟菊酯，兩種方法的測定結果為1.06和1.03 μg/L，對氟節(jié)胺和聯苯菊酯均無法進行定量分析；在樣品C中測到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，兩種方法的測定結果為92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，對七氟菊酯也均無法進行定量分析。結果表明，本方法與標準方法[11]的檢測結果相吻合。樣品C中測到的目標物數目最多，給出了其中被測到目標物的典型色譜圖。如圖4所示，目標物均不存在干擾。同時，對凈化前的煙葉提取液直接進行在線GPC-GC-MS/MS分析，檢測結果與以上兩種方法不存在顯著性差異：在樣品B中測到了七氟菊酯，其濃度為1.01 μg/L；在樣品C中測到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，其濃度為92.8， 110.2和3.81 μg/L。

將上述3種樣品加標后用本方法測定，將所測量與實際加標量相比得到相對回收率。如表4所示，目標物的相對回收率在68.8%～132.2%之間，不同實際樣品中目標物在不同濃度下的回收率相差較大，可能是因為不同產地煙葉樣品的基質差異引起的。使用氣相色譜-串聯質譜檢測煙葉中的農藥殘留時，基質增強效應和基質抑制效應同時都存在[13]，其中含有氨基的極性農藥化合物在氣相色譜分析時主要表現為基質增強效應（如二甲戊靈和聯苯菊酯，回收率最高為132.2%），但含有同一功能基團的化合物由于理化特性的差異所呈現的基質效應也會有較大差別（如七氟菊酯，回收率最低為68.8%），而且同一化合物在不同濃度水平和樣品基質下產生的基質效應程度也不盡相同（如甲氰菊酯）[14]。

4 結 論

采用磁性吸附劑凈化煙葉提取液，再用在線GPC-GC-MS/MS檢測，優(yōu)化了在線GPC-GC-MS/MS條件和影響凈化效果的因素，在最佳的條件下建立了煙葉樣品中10種農藥殘留量的測定新方法，并用于實際煙葉樣品的測定。由于磁性吸附劑可以在磁場作用下實現快速回收，且在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)可以提高進樣量。與現有標準方法[11]相比，本方法具有樣品前處理過程操作簡單、凈化能力強、靈敏度高等優(yōu)點，為日常煙葉樣品中農藥殘留量的測定提供了一種可選擇的方法。

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