基于流動(dòng)注射光度法的吸光度/留存時(shí)間比自動(dòng)測(cè)定過氧化物酶活性方法

李永生　鄭巍　高秀峰

摘 要 本研究給出了流動(dòng)注射分光光度系統(tǒng)（FI-SP）測(cè)定酶活性濃度（Ec）的通用公式Ec=kΔA/Δt； Δt是在酶促反應(yīng)線性響應(yīng)區(qū)域內(nèi)試樣塞的平均留存時(shí)間；ΔA為平均留存時(shí)間處對(duì)應(yīng)的吸光度； k=nV/（εvL），V為樣品注入點(diǎn)到流通池入口之間的管路總?cè)莘e，n為酶底物與產(chǎn)物的反應(yīng)摩爾比，ε為產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)，v為注入的酶液體積，L為流通池光程；FI-SP系統(tǒng)確定后k為常數(shù)。在此基礎(chǔ)上，將H2O2/過氧化物酶（POD）/愈創(chuàng)木酚（GA）反應(yīng)體系導(dǎo)入FI-SP系統(tǒng)，建立了一種無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線的POD活性快速準(zhǔn)確測(cè)定的新方法。此方法優(yōu)化后的條件：載流磷酸鹽緩沖液濃度為0.05 mol/L（pH 5.5），進(jìn)樣體積為40 μL，反應(yīng)盤管長(zhǎng)度200 cm， 1.5 mmol/L H2O2，3.5 mmol/L GA，0.4 mol/L HCl（清洗液），檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)為0.0125 L（μmol ·cm）。本方法的重現(xiàn)性RSD<0.38%（n=11），分析速度為40樣/h，測(cè)定范圍為450～7260 U/L，檢出限為89 U/L。在優(yōu)化條件及60℃下，用本方法測(cè)定了多種白蘿卜中POD活性，結(jié)果與動(dòng)力學(xué)曲線法完全相同。

關(guān)鍵詞 流動(dòng)注射分析；過氧化物酶；蘿卜提取液；愈創(chuàng)木酚；過氧化氫

1 引 言

過氧化物酶（POD， EC 1.11.1.7）是一種廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)的酶，被應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)[1]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[2]、有機(jī)合成[3]和食品分析[4]等領(lǐng)域，大多數(shù)生化試劑盒都含有POD，其最重要的指標(biāo)就是酶活性。因此，POD活性的快速準(zhǔn)確定量尤為重要。POD能催化酚類或胺類顯色試劑與H2O2的反應(yīng)；常用的顯色試劑有鄰苯二胺[5]、季胺[6]、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）[7]、鄰苯三酚[8]、愈創(chuàng)木酚（GA）[9]、以及胺和酚類的耦合物[1，10]。這些顯色劑在POD催化下與H2O2反應(yīng)生成的產(chǎn)物都可通過比色法進(jìn)行定量，但最常用的顯色劑是低毒性、廉價(jià)的GA。早先認(rèn)為H2O2/POD/GA體系的產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚四聚體（4-GA）[9]，但新的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚二聚體（2-GA）[11～13]。我們驗(yàn)證了此結(jié)果并發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物不穩(wěn)定，會(huì)很快分解成其它物質(zhì)而褪色[14]， 這導(dǎo)致采用手工比色法定量POD活性時(shí)得到的結(jié)果重現(xiàn)性很差。此外，由于該產(chǎn)物不穩(wěn)定，難以提純，所以只能通過反應(yīng)物GA的濃度間接地求得反應(yīng)體系中產(chǎn)物2-GA的摩爾吸光系數(shù)（ε）[15]，并用此ε值去計(jì)算POD活性；但這又會(huì)由于ε差異導(dǎo)致得到的POD活性值產(chǎn)生較大的誤差。

測(cè)定POD活性方法除比色法外[16]， 還有熒光光度法[17，18]和化學(xué)發(fā)光法[19～21]等。測(cè)定POD活性的手工熒光法和化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍寬；但是，由于POD催化反應(yīng)的產(chǎn)物激發(fā)波長(zhǎng)在紫外區(qū)，所以被測(cè)樣品中存在的雜蛋白會(huì)對(duì)熒光法產(chǎn)生干擾；手工化學(xué)發(fā)光法的靈敏度雖高但測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性較差。流動(dòng)注射分析（Flow injection analysis， FIA）作為一種自動(dòng)化分析技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、精度高等優(yōu)點(diǎn)[22]，它能與各種檢測(cè)器組合用于酶活性的自動(dòng)快速測(cè)定[23～25]。Holm[7]用ABTS作為供氫體，利用流動(dòng)注射光度法對(duì)發(fā)酵樣品中微生物POD活性進(jìn)行了測(cè)定；但此方法的不足之處是ABTS試劑的價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性也較差。本研究選擇價(jià)廉、穩(wěn)定、且被廣泛應(yīng)用的GA作為供氫體，基于FIA光度法建立了一種新的測(cè)定POD活性的分析流路（Flow-injection spectrophotometry for POD， FIA-SP-POD），并對(duì)蘿卜提取液中的POD含量及活性進(jìn)行了測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

安裝10 mm光程流通池的UV-1800PC型紫外/可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；800-1型離心機(jī)（常州普天儀器制造有限公司）；JYZ-E6型原汁機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；FIA-3100流動(dòng)注射處理儀（北京吉天儀器有限公司）；ASB-200恒溫控制器（日本分光株式會(huì)社）；CP224S分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；pXJ-1C+離子活度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鄭州金育科貿(mào)有限公司）；800B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

GA （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、HRP（≥250 U/mg， Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電導(dǎo)率0.065 μS/cm）；其余試劑均為分析純。新鮮白蘿卜購(gòu)于本地超市。

2.2 蘿卜粗酶液制備

稱取50 g新鮮白蘿卜，切成小塊（約1 cm3），置于榨汁機(jī)中榨汁，用真空泵將濾渣進(jìn)行抽濾，合并兩次收集的濾液，然后在4000 r/min下離心10 min；最后用針式過濾器（13 mm/0.45 μm）將離心上清液進(jìn)行過濾；濾液即為粗酶液， 置于冰箱4℃下保存。

2.3 測(cè)定原理

2.4 FIA系統(tǒng)及測(cè)定過程

FIA-SP-POD系統(tǒng)見圖1。測(cè)定過程為：當(dāng)雙通道注入閥（V）轉(zhuǎn)至“采樣”位置時(shí)，酶試樣在P1的抽吸作用下充滿樣品定量環(huán)（SL），多余的樣品從W2排出，采用P1抽吸采樣，可縮短試樣流經(jīng)途徑，達(dá)到節(jié)省試樣目的；當(dāng)此閥轉(zhuǎn)至“注入”位置時(shí)，PBS緩沖液載流（C）推動(dòng)SL中“酶樣品塞”進(jìn)入反應(yīng)盤管，與反應(yīng)試劑（R1）匯合，樣品塞中的POD催化H2O2/GA反應(yīng)生成2-GA，流經(jīng)流通式檢測(cè)器，給出吸光度信號(hào)（A）；試樣從注入到產(chǎn)物出現(xiàn)最大吸收峰之間的留存時(shí)間為Δt；與此同時(shí)，HCl清洗液被P2吸入清洗液定量環(huán)（RL），多余的清洗液從W1排出。當(dāng)此閥再轉(zhuǎn)至“采樣”位置時(shí)，PBS緩沖液載流（C）推動(dòng)RL中的HCl清洗液塞，依次進(jìn)入反應(yīng)盤管和流通池進(jìn)行自動(dòng)清洗，檢測(cè)器給出基線信號(hào)（Ao），兩者之差為ΔA（A-Ao）。將此ΔA/Δt代入公式（3）可求得Ec。

3 結(jié)果與討論

3.1 FIA系統(tǒng)參數(shù)的優(yōu)化

基于前期手工法[27]將FIA-SP-POD系統(tǒng)的初始條件設(shè)定如下：1.5 mmol/L GA，0.5 mmol/L H2O2，兩者等體積混合作為R1； POD樣品的注入體積60 μL；0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）作為載流；0.4 mol/L HCl作為清洗液；P1轉(zhuǎn)速20 r/min （1.73 mL/min），P2轉(zhuǎn)速20 r/min；反應(yīng)盤管（Φ 0.8 mm）長(zhǎng)度為200 cm；背壓管（Φ 0.3 mm）長(zhǎng)度為50 cm。采用單因素優(yōu)選法考察了FIA法測(cè)定POD活性時(shí)的影響因素。

3.1.1 反應(yīng)盤管最適長(zhǎng)度的考察 在FIA-SP-POD系統(tǒng)中，反應(yīng)盤管長(zhǎng)度影響反應(yīng)進(jìn)程和分析速度。因此，用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品，考察了RC長(zhǎng)度（150， 200， 250， 300和350 cm）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響。得到的結(jié)果表明，RC長(zhǎng)度增加，產(chǎn)物吸光度先增大后逐漸減小，RC長(zhǎng)度在200 cm 時(shí)ΔA最大。其原因是：RC長(zhǎng)度較短時(shí)反應(yīng)時(shí)間短，導(dǎo)致反應(yīng)不充分；RC太長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率小于其在管路中被稀釋的速率，導(dǎo)致吸光度值緩慢下降。所以本系統(tǒng)的RC選定為200 cm。

3.1.2 試樣環(huán)最適體積的考察 FIA-SP-POD系統(tǒng)中采樣環(huán)（SL）的體積即為POD溶液的體積，系統(tǒng)中加入的POD量不同導(dǎo)致酶催化速率不同，進(jìn)而影響FIA系統(tǒng)的靈敏度，因此，在RC為200 cm的前體下，考察了SL（30， 40， 50， 60和70 μL）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響。結(jié)果表明，SL增加基本上不影響產(chǎn)物吸光度值；

其原因可能是H2O2與GA反應(yīng)已達(dá)到平衡，再增加SL僅僅是酶過量而沒有增加反應(yīng)產(chǎn)物的生成量?？紤]到方法靈敏度及節(jié)省試樣的因素，選定SL為40 μL。

3.1.3 FIA系統(tǒng)基線漂移的消除 研究發(fā)現(xiàn)，在FIA-SP-POD系統(tǒng)中H2O2與GA反應(yīng)所生成的褐色2-GA，容易吸附在流通池中，導(dǎo)致FIA系統(tǒng)的基線漂移。所以，為了減小由于2-GA導(dǎo)致的基線漂移，在FIA系統(tǒng)導(dǎo)入清洗液。即在FIA流路中設(shè)計(jì)了一個(gè)異步注入閥，利用此閥將清洗液在“酶試樣塞”之后注入FIA系統(tǒng)（60 μL），以達(dá)到對(duì)FIA系統(tǒng)自動(dòng)清洗，減小基線漂移的效果。

為了考察此效果，在FIA系統(tǒng)中分別用HCl和NaOH作為清洗液，蘿卜提取液作為測(cè)試樣品，得到了圖2中的兩條實(shí)測(cè)曲線。隨著清洗液濃度（HCl和NaOH）增加，基線漂移值減??；在相同濃度下，HCl的清洗效果（基線漂移值）優(yōu)于NaOH。所以，最后選取0.4 mol/L HCl溶液作為清洗劑。

3.2 反應(yīng)體系影響因素的考察

3.2.1 POD最適溫度 溫度是影響POD活性的因素之一。低溫使酶活性不能完全顯現(xiàn)，高溫又會(huì)使酶蛋白變性，喪失活性。將FIA-SP-POD系統(tǒng)的RC置于恒溫控制器內(nèi)，先用熱電偶對(duì)RC出口液的溫度進(jìn)行校正，然后用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品，在不同溫度下（25℃～70℃）考察了溫度與白蘿卜POD活性的相關(guān)性。結(jié)果見圖3a。在60℃時(shí)， 酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的ΔA最大（此時(shí)FIA系統(tǒng)的平均留存時(shí)間Δt都相同，所以ΔA與反應(yīng)速率ΔA/Δt及Ec成正比關(guān)系），當(dāng)溫度大于60℃時(shí)， ΔA開始降低，即高溫導(dǎo)致POD失活，POD的催化活力下降。由此可知白蘿卜POD最適溫度為60℃，此結(jié)果與文獻(xiàn)＼[28＼]一致。

3.2.2 POD最適pH值 酸度對(duì)酶活性的影響，不是酸、堿對(duì)酶分子解離狀態(tài)的影響，而是對(duì)酶活性中心或相關(guān)基團(tuán)解離狀態(tài)的影響。因此本實(shí)驗(yàn)用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品，考察了磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）的酸度（pH 3.0～9.0）對(duì)反應(yīng)體系中POD活性的影響。除溫度控制在60℃外，其它條件同上。由圖3b所示的結(jié)果可知，當(dāng)pH 在3～5.5范圍時(shí)，pH 增加，ΔA增大，即POD催化生成的產(chǎn)物增多；在pH 5.5～9.0范圍時(shí)，pH 增加，ΔA反而降低，即POD催化生成的產(chǎn)物減少；在pH 5.5時(shí)產(chǎn)物最多即POD活性最強(qiáng)。由此可知蘿卜中所含的POD的最適pH 為5.5。

3.2.3 H2O2濃度的考察 在上述優(yōu)選條件下，考察反應(yīng)體系中H2O2濃度（0～2.0 mmol/L）對(duì)POD催化反應(yīng)的影響。得到的結(jié)果見圖3c?？梢钥闯觯涸诮o定的Δt值下，H2O2濃度增加，產(chǎn)物ΔA逐漸增大，當(dāng)此濃度大于1.5 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物ΔA不再變化，即POD催化產(chǎn)物的生成速率趨于穩(wěn)定。因此， 將H2O2濃度設(shè)定為1.5 mmol/L。在此基礎(chǔ)上，以H2O2為底物作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，根據(jù)雙倒數(shù)圖的截距，計(jì)算得到以H2O2為底物的米氏常數(shù)（Km）為0.21 mmol/L，酶促反應(yīng)最大速度（Vmax）為1.155 mmol/（L·min）。

3.2.4 GA濃度的考察 在上述優(yōu)選條件下，也考察了GA濃度（0～4.0 mmol/L）對(duì)POD酶催化反應(yīng)的影響。得到的結(jié)果見圖3d。在給定的Δt值下，曲線的變化趨勢(shì)與H2O2底物相似，即隨著GA/POD/H2O2反應(yīng)體系中GA濃度增大，ΔA先迅速增大后不再變化；當(dāng)濃度大于3.5 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速率（ΔA/Δt）趨于穩(wěn)定。故本系統(tǒng)選定GA濃度為3.5 mmol/L。同樣以GA為底物作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，再根據(jù)此圖計(jì)算出以GA為底物的Km′和Vmax′值分別為0.20 mmol/L和0.539 mmol L1·min1。結(jié)果表明：白蘿卜POD與GA之間的親和力與H2O2相差不大。

3.3 干擾離子對(duì)POD活性測(cè)定影響

金屬離子可能與POD形成絡(luò)合物進(jìn)而影響POD活性，本實(shí)驗(yàn)考察了4種鹽溶液（FeCl3， CuSO4， ZnSO4， CoSO4）對(duì)POD活性測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)，白蘿卜POD作為測(cè)試樣品，在0～0.8 mmol/L范圍內(nèi)改變FIA-SP-POD系統(tǒng)載流中的金屬離子濃度，得到的結(jié)果見圖4。從圖4a可知，隨著Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+濃度的增加，在給定的Δt值下，相關(guān)的ΔA都有增大的趨勢(shì)，即Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+對(duì)POD均有一定程度的激活作用；POD激活順序?yàn)镕e3+ > Cu2+ > Zn2+ > Co2+。所以，在提取白蘿卜POD時(shí)，要避免接觸這些金屬離子，防止發(fā)生酶促褐變。

此外，在載流中分別添加檸檬酸（0～20 mmol/L）、抗壞血酸（0～0.2 mmol/L）和L-半胱氨酸（0～2.0 mmol/L），考察了這些有機(jī)酸類對(duì)POD活性的影響。從得到的圖4b～d 3條曲線可以看出：添加的有機(jī)酸濃度增大，在給定的Δt值下吸光度都逐漸降低。這表明這3種有機(jī)酸對(duì)POD活性有明顯的抑制作用，其抑制作用順序?yàn)榭箟难?L-半胱氨酸>檸檬酸。由于L-半胱氨酸和檸檬酸都與POD活性中心的Fe3+發(fā)生螯合反應(yīng)，使酶活性中心失去催化功能，因而抑制了POD的活性或減弱了POD與底物的親和力。

3.4 摩爾吸收系數(shù)測(cè)定

常規(guī)比色法測(cè)定POD活性時(shí)，是利用H2O2/POD/GA體系反應(yīng)產(chǎn)物在470 nm處的ΔA值，帶入公式（2）計(jì)算得到。但本研究發(fā)現(xiàn)：ε值是準(zhǔn)確定量POD酶活性的最關(guān)鍵因素；當(dāng)所用儀器（波長(zhǎng)分辨率、靈敏度）及方法的測(cè)試條件（溫度、pH 及溶劑）不同時(shí)得到的ε不同。所以，計(jì)算POD活性時(shí)不能直接將文獻(xiàn)或商家給出的ε值代入公式（2）進(jìn)行計(jì)算，須在選定條件下用所選儀器進(jìn)行測(cè)定。

因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定ε2-GA方法進(jìn)行了研究。由于2-GA不穩(wěn)定、無(wú)法提純，不能通過直接測(cè)定其吸光度值得到ε2-GA值，只能利用GA濃度間接求出2-GA的濃度（2H2O+2GA（POD）2-GA+4H2O）。理論上，當(dāng)H2O2/POD/GA體系中POD過量， 且H2O2濃度遠(yuǎn)大于GA時(shí)，可認(rèn)為GA完全轉(zhuǎn)化為2-GA。所以， 對(duì)所需的POD活性濃度、H2O2/GA濃度比進(jìn)行了考察。

3.4.1 GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的HRP活性濃度 用商品化的HRP作為測(cè)試樣品，分別取20 μL的50， 100， 250， 500， 1000和2500 U/L HRP，加入0.5 mmol/L H2O2+1.5 mmol/L GA混合液中[26]測(cè)定2-GA的吸光度，結(jié)果見圖5a。當(dāng)HRP濃度小于1.0 kU/L時(shí)，2-GA的吸光度隨HRP活性濃度增加而增大，當(dāng)HRP濃度大于1.0 kU/L時(shí)，2-GA的吸光度不再變化，即此時(shí)HRP活性濃度能使GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。

3.4.2 GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的H2O2的濃度 選定HRP為1.0 kU/L、GA濃度為0.2 mmol/L，使其與不同濃度的H2O2（0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和2.0 mmol/L）按1+1混合，測(cè)定其產(chǎn)物2-GA的吸光度，結(jié)果見圖5b，產(chǎn)物吸光度隨H2O2濃度增加呈線性增加趨勢(shì)，當(dāng)H2O2濃度大于GA濃度的5倍時(shí)，產(chǎn)物吸光度不再隨H2O2濃度而變化。由此得出結(jié)論：當(dāng)HRP為1.0 kU/L、H2O2/GA濃度比大于5時(shí)，GA能完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2-GA。因此，此時(shí)可根據(jù)已知的GA濃度換算出反應(yīng)系統(tǒng)中的2-GA濃度，再將其帶入朗伯-比爾定律，就求得ε2-GA。在室溫（～20℃）下，用手工比色和5點(diǎn)平均數(shù)據(jù)得到的ε2-GA值為0.0122±0.0031 L/（μmol·cm）。

3.4.3 產(chǎn)物摩爾吸收系數(shù)的平均值 為了得到FIA法測(cè)定白蘿卜POD的ε2-GA，用稀釋一倍后的白蘿卜粗酶液作為樣品（Ec>1.0 kU/L），F(xiàn)IA系統(tǒng)中載流為PBS緩沖液（pH 5.5），R1（H2O2/GA）按1+1混合、且濃度比大于5 （H2O2/GA： 1.5/0.01， 1.5/0.04， 1.5/0.08， 1.5/0.12， 1.5/0.16， 1.5/0.20和1.5/0.24 mmol/L），在60℃下測(cè)定了FIA-SP-POD系統(tǒng)中H2O2/POD/GA反應(yīng)體系形成的產(chǎn)物吸光度，并將換算出的2-GA濃度（1.25， 5， 10， 15， 20， 25和30 μmol/L，c2-GA= 1000×（cGA/4）/2）與其吸光度值進(jìn)行數(shù)學(xué)回歸，最后得到相關(guān)的線性方程：ΔA=0.0125c2-GA+0.050 （r=0.9995）；此斜率值0.0125 L （μmol cm）1即為本系統(tǒng)的ε2-GA平均值。

3.5 蘿卜POD活性測(cè)定

考察了POD的線性響應(yīng)范圍和精密度以及檢出限。在優(yōu)選條件下，一系列HRP標(biāo)液作為樣品，用FIA-SP-POD系統(tǒng)檢出它們?cè)讦下的ΔA值，然后代入公式3，求出對(duì)應(yīng)的POD活性值。結(jié)果表明：在給定的Δt（0.53 min）下，在450～7260 U/L范圍內(nèi)HRP活性濃度與ΔA值呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（ΔA=0.00013Ec+ 0.0012，r=0.9985）。隨后，分別用500 U/L、2500 U/L HRP標(biāo)液進(jìn)行11次測(cè)定，得到兩組標(biāo)液的RSD分別為0.62%（c=501±3 U/L）、0.31%（c=2530±8 U/L）；此結(jié)果表明本方法測(cè)定POD活性濃度的精度很好；用 500 U/L HRP為樣品，計(jì)算得到本方法的檢出限為7.0 U/L （cL=3SD/K， SD=0.000326， K=0.00013）。

用pH 5.5磷酸鹽緩沖液將蘿卜提取液按10%， 15%， 20%， 25%， 30%和35%比例稀釋成6個(gè)樣品（Ec10～Ec35），分別注入FIA-SP-POD系統(tǒng)，在給定的Δt下，檢測(cè)其催化產(chǎn)物的ΔA（0.067， 0.105， 0.135， 0.170， 0.193， 0.220），得到了一條蘿卜提取液與ΔA呈良好線性關(guān)系的相關(guān)曲線（ΔA=0.638c+0.004， r=0.9965）， 表明本方法基于平均留存時(shí)間（Δt）處的ΔA能快速準(zhǔn)確地定量POD活性濃度。

另外，模擬手工酶動(dòng)力學(xué)曲線法在本系統(tǒng)上采用流動(dòng)注射停留法，對(duì)上述稀釋的蘿卜POD活性進(jìn)行了測(cè)定。操作過程是：注入酶樣品32s后停泵（在響應(yīng)峰的最大值之后停泵），連續(xù)記錄H2O2/POD/GA體系在后30s期間內(nèi)的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線（ΔA vs Δt），根據(jù)此區(qū)間曲線的斜率，求得POD活性濃度。得到的數(shù)據(jù)表明，停留法的結(jié)果（Ec10：777±3 U/L，Ec15：1211±13 U/L，Ec20：1470±14 U/L，Ec25：1760±30 U/L， Ec30：2075±20 U/L，Ec35：2268±23 U/L）與上述FIA-SP-POD系統(tǒng)的結(jié)果（Ec10：706±8 U/L，Ec15：1105±6 U/L，Ec20：1425±22 U/L，Ec25：1802±6 U/L，Ec30：2034±27 U/L，Ec35：2323±32 U/L）是一致的。

選取4種蘿卜的提取液作為酶樣品，用FIA-SP-POD系統(tǒng)測(cè)定其產(chǎn)物的吸光度，然后代入公式3，得到POD活性值。得到結(jié)果為：紅皮蘿卜（14673 U/L）>青蘿卜（14365 U/L）>圓蘿卜（13076 U/L）>白蘿卜（8309 U/L）。為了考察本方法的可靠性，用HRP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)（表1）?？紤]到HRP自然失活的影響，每次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)前先對(duì)HRP活性進(jìn)行了校正。本方法的回收率在95.2%～107.1%之間，結(jié)果滿意。

4 結(jié) 論

本研究基于H2O2/POD/GA反應(yīng)體系，利用流動(dòng)注射吸光度/留存時(shí)間比值法，建立了一種無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線的POD活性快速準(zhǔn)確測(cè)定新方法，分析速度可達(dá)40樣/h。用本方法測(cè)定POD活性，不但減少了手工操作帶來的誤差，而且具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、分析速度快、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。

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