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    碳納米管修飾的紙傳感器用于檢測甲胎蛋白

    2015-11-03 07:50:24周雪等
    分析化學 2015年10期
    關(guān)鍵詞:甲胎蛋白濾紙碳納米管

    周雪等

    摘 要 根據(jù)碳納米管能隙變化和管之間接觸電阻變化引起碳納米管整個網(wǎng)絡(luò)體系導電性變化的原理,研制了一種基于碳納米管的新型紙傳感器,可靈敏檢測甲胎蛋白(AFP)。利用F108對碳納米管進行功能化改性,制備均勻、穩(wěn)定的碳納米管分散液,在分散液中加入AFP抗體,獲得的碳納米管-抗體溶液用于浸漬濾紙以使濾紙導電,通過測量由于免疫反應(yīng)引起的紙傳感器導電性變化,可實現(xiàn)AFP的快速、準確檢測。浸漬12次的紙傳感器的電阻變化值與AFP濃度在0.156~100 ng/mL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,樣品檢測時間僅為5 min,并且在同一張紙條上可實現(xiàn)多次檢測,使用方法簡單,成本低廉,具有很高的靈敏度和選擇性。用本法檢測臨床血清樣品中AFP含量,結(jié)果與臨床常用的ELISA法相比無顯著性差異。

    關(guān)鍵詞 碳納米管; 甲胎蛋白; 濾紙; 免疫傳感器

    1 引 言

    甲胎蛋白(α-Fetoprotein, AFP)是一種分子量為69 kDa的糖蛋白,是原發(fā)性肝癌的標記物之一,血清中AFP的升高對原發(fā)性肝癌的診斷具有非常重要的意義[1,2]。正常人的血清中AFP的含量一般低于20 ng/mL,若明顯升高則可能患有肝腫瘤。癌癥的早期診斷對于癌癥的成功治愈、患者成活率的提高至關(guān)重要。在癌癥早期階段,腫瘤標記物的含量非常低,而目前臨床檢測常用的大多數(shù)分析儀器所需的分析時間較長。為滿足日益增多的癌癥前期或癌癥早期惡性病變臨床篩查的需求,迫切需要發(fā)展可實現(xiàn)快速、高靈敏檢測的微型儀器。

    納米技術(shù)的發(fā)展,以及隨之而發(fā)展起來的新的納米探針、納米傳感器和納米分析體系大大擴展了生物傳感技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用。碳納米管具有的獨特的物理、化學、光學和電學性質(zhì),為光電信號傳導和新一代生物電子/生物傳感器件的設(shè)計提供了優(yōu)良的平臺[3]。特別是經(jīng)DNA、酶、抗體等生物分子功能化的碳納米管,既具有碳納米管本身的大比表面積效應(yīng)和優(yōu)良的電傳導性能,也具備生物分子的特異性識別能力,基于生物分子功能化的碳納米管構(gòu)建的生物傳感器可以有效地加速信號傳導,實現(xiàn)信號放大,提高檢測的靈敏度和選擇性,減少所需樣品和試劑的用量。因此,將碳納米管應(yīng)用于免疫傳感器已引起人們的廣泛關(guān)注[4~6]。

    目前,碳納米管的免疫傳感器研究主要是將其作為傳感器的電極修飾材料,制作高特異性、高靈敏度的電化學免疫傳感器[7~9],然而,這類傳感器通常需要使用價格比較昂貴的玻碳或者鉑、金等貴金屬作為電極材料,限制了其進一步的推廣應(yīng)用[10]。本研究采用廉價易得的標準化學分析濾紙為基底,利用碳納米管/抗體混合液對濾紙進行包覆制作紙傳感器,基于簡單的抗原-抗體特異性反應(yīng)的原理,通過檢測紙傳感器導電性的變化實現(xiàn)AFP含量的測定。制備的紙傳感器靈敏度和檢出限皆可媲美傳統(tǒng)的ELISA試劑盒,且分析時間大大縮短,只需5 min即可得到樣品的檢測結(jié)果,適用于常規(guī)的癌癥篩選。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    KQ-500DE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);HT7700透射電子顯微鏡與S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本日立公司);Z-603S 3D打印機(深圳市極光爾沃科技有限公司);DT-5302四線低電阻測量儀(深圳華盛昌機械實業(yè)有限公司);

    標準化學分析濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司);單壁碳納米管(SWCNTs,直徑1~2 nm,長度5~30 μm,純度>95%,中科院成都有機所);Pluronic F108(PEO136-PPO45-PEO136,Mw=14600,F(xiàn)Luka公司);AFP單克隆抗體及AFP(鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司);0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4);其余試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

    2.2 碳納米管-抗體溶液的制備

    準確稱取適量SWCNTs與1% (w/w)的F108溶液混合,在40 kHz條件下超聲12 h使之分散,制備濃度為5 mg/mL的碳管分散液。在10 mL F108/SWCNTs分散液中直接加入AFP單抗1 μL,使抗體終濃度為1 μg/mL,于微量振蕩器上振蕩, 使抗體均勻分散在碳管液中,最終碳管與抗體質(zhì)量比約為5000∶1。

    2.3 免疫紙傳感器的制備

    將濾紙裁成5 cm×0.5 cm的濾紙條,浸入碳納米管-抗體溶液中,使其與溶液充分接觸,靜置10 min后取出,低溫干燥30 min,以便最大限度減小抗體的變性失活。重復(fù)上述浸漬-干燥循環(huán),直至濾紙條上沉積足量的碳管和抗體。將干燥好的傳感器置于4℃保存。利用掃描電鏡對紙傳感器進行表征。

    2.4 甲胎蛋白的檢測方法

    用CAD2014軟件設(shè)計濾紙夾持裝置3D模型,再利用3D打印機制作其實體結(jié)構(gòu)。利用夾持裝置固定紙傳感器,采用DT-5302四線低電阻測量儀作為檢測儀器,檢測時調(diào)至電阻檔。測試時取1 μL樣品滴至紙傳感器上進行測定,樣品滴加在傳感器上會形成一個直徑約為0.5 cm的濃縮、飽和的區(qū)域,在這個區(qū)域外圍放置兩個銅片電極,檢測電阻變化。記錄測量區(qū)域的起始電阻值與加樣5 min內(nèi)的最大電阻值,兩者的差值記為ΔR,以此作為電阻對抗原濃度的信號響應(yīng)的度量,衡量免疫反應(yīng)前后紙傳感器導電性的變化。3 結(jié)果與討論

    3.1 SWCNTs的電鏡表征

    由于SWCNTs的生物相容性及其在溶劑中的分散穩(wěn)定性較差,常需要對SWCNTs進行生物功能化改性[11],在碳納米管表面包裹具有生物相容性的聚合物,是一種在碳管表面固定生物分子的一種有效手段[12]。F108是一種生物相容性好的高分子聚合物,其不僅可以防止碳納米管的聚集,而且可以為進一步的生物分子功能化提供有效位點,保持抗體的生物構(gòu)型及活性,對抗體起到一定的保護作用[13]。

    利用透射電鏡(TEM)觀察分散前后SWCNTs的微觀形貌。如圖1a所示,最初的碳管比較長且相互纏繞,表面存在金屬催化劑及無定形碳等雜質(zhì)。從圖1b可見,SWCNTs在F108溶液中呈現(xiàn)單根或小管束的分散狀態(tài),分散的碳管直徑約為5 nm,碳管均勻分散在懸浮液中, 并且不再呈現(xiàn)聚集狀,成為均勻、穩(wěn)定的碳管分散液。

    3.2 紙傳感器的制作和形貌表征

    經(jīng)過浸漬-干燥循環(huán),碳納米管與抗體復(fù)合溶液一層層地包覆到濾紙表面,制作傳感器的循環(huán)數(shù)即為濾紙上的沉積層數(shù)。從圖2可以看出經(jīng)過SWCNTs-抗體溶液的沉積,濾紙由白變黑的過程。

    利用掃描電鏡(SEM)觀察包覆碳納米管和抗體前后紙傳感器的表面特征,比較空白濾紙與紙傳感器表面形貌(圖3)可見,空白濾紙表面粗糙的紙纖維,浸漬有碳管和抗體的濾紙上包覆了非常致密的碳納米管和抗體層。由于SWCNTs本身即具有良好的導電性,濾紙條上不需要再添加其它任何導電性物質(zhì),將SWCNTs層層沉積到濾紙表面就能形成導電網(wǎng)絡(luò)。并且隨著SWCNTs沉積層數(shù)的增加,紙傳感器的電阻不斷減小,導電率不斷提高,最終獲得了高性能的導電傳感器。

    3.3 紙傳感器的檢測裝置與工作原理

    依據(jù)在紙傳感器上滴加1 μL樣品后樣品擴散區(qū)域大小,設(shè)計如圖4所示的紙傳感器的檢測裝置,兩個銅片電極間的檢測區(qū)域為0.5 cm×0.5 cm,在一張紙條上可實現(xiàn)多次檢測,大大降低了使用成本。

    圖5為本實驗的原理示意圖,當含有AFP的樣品滴加于紙傳感器時,樣品中的AFP與濾紙上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合,從而形成抗原-抗體免疫復(fù)合物,此復(fù)合物可將層層堆疊相鄰的SWCNTs分開,使得碳管之間的間隙變大。由于碳管網(wǎng)絡(luò)的電阻是由管間接觸電阻和碳管本身的電阻兩部份構(gòu)成,所以碳管間間隙變大,會引起管間接觸電阻的升高,從而引起整個碳納米管網(wǎng)絡(luò)體系導電性的巨大變化,外部表現(xiàn)為紙傳感器電阻升高,紙傳感器電阻的變化與樣品中AFP的濃度相關(guān)聯(lián),因此可實現(xiàn)樣品中AFP含量的檢測。本研究制備的紙傳感器的原理與文獻\[14\] 報道的利用SWCNTs制備的靈敏度和特異性極高的檢測目標蛋白的生物傳感電子紡織物的原理相反。對于這種生物傳感電子紡織物, 當溶液中有抗原存在時檢測到的電流增大,這是因為SWCNTs-棉線傳感器在檢測目標物——血清白蛋白時,抗體從SWCNTs中脫落與溶液中的抗原進行了結(jié)合,使得碳管之間的間隙變小,從而降低了整個碳管網(wǎng)絡(luò)的電阻。

    3.4 浸漬次數(shù)的優(yōu)化

    本實驗中,紙傳感器在碳納米管-抗體溶液中的浸漬次數(shù)是非常重要的參數(shù),與紙傳感器的靈敏度有關(guān),也影響檢測AFP抗原時的線性范圍。實驗結(jié)果表明,電阻變化值(ΔR)隨紙傳感器浸漬次數(shù)的增加而增大,即紙傳感器的靈敏度逐漸提高。當浸漬次數(shù)增加到12次后,再繼續(xù)增加浸漬次數(shù),ΔR變化不大,表明濾紙表面負載量趨于飽和,因此,選擇浸漬12次作為最適的浸漬次數(shù)。 圖6 電阻變化值與AFP抗原濃度的關(guān)系

    Fig.6 Linear relationship between resistance difference value and α-fetoprotein (AFP) concentration

    3.5 紙傳感器對AFP的響應(yīng)性能

    在優(yōu)化的實驗條件下,對不同濃度的AFP進行測定(圖6)。隨著AFP濃度的增加,紙傳感器的ΔR逐漸變大,且ΔR與AFP濃度在0.156~100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為ΔR=4.80c+4.82, R2=0.9969,檢出限為0.156 ng/mL(3σ)。

    3.6 紙傳感器的特異性

    特異性是衡量免疫傳感器性能的重要指標。分別在紙傳感器上滴加20 ng/mL AFP溶液(a)和含有20 ng/mL AFP以及模擬血清中可能存在的干擾物(癌胚抗原、免疫球蛋白、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原以及牛血清白蛋白、抗壞血酸)溶液(b),在最佳條件下進行重復(fù)測定,記錄ΔR,結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明,兩種溶液的電阻響應(yīng)值無顯著差異(p>0.05),表明此紙傳感器的特異性好,抗干擾能力強。

    3.7 紙傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

    在同一張紙傳感器上5個不同區(qū)域分別滴加20 ng/mL AFP抗原標準溶液,檢測ΔR,5次測量的相對標準偏差(RSD)為3.5%;取不同批次制備的5個紙傳感器,對20 ng/mL AFP抗原標準溶液進行檢測,相對標準偏差(RSD)為9.3%,表明制備的紙傳感器有較好的重現(xiàn)性。為考察紙傳感器的穩(wěn)定性,將制備的紙傳感器置于4℃保存,定期檢測電信號變化,4周后,其信號響應(yīng)比較穩(wěn)定,測定20 ng/mL AFP的響應(yīng)值為 初始信號的95%,說明紙傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

    3.8 實際樣品分析

    為檢驗本方法對AFP檢測的準確性,采集4份人血清樣品,用紙傳感器測定其中的AFP含量(表2)。與臨床ELISA方法得到的結(jié)果相比,紙傳感器顯示了良好的準確性,兩種方法的結(jié)果吻合,呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

    結(jié)果表明,紙傳感器方法操作簡單、靈敏度高、特異性強,可用于臨床血清樣品中甲胎蛋白的檢測。

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