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      草蓯蓉中四種活性成分的提取與分析

      2012-09-12 00:55:44董長穎于加平
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年16期
      關(guān)鍵詞:綠原酸高效液相色譜法多糖

      董長穎 于加平

      摘要:以體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇為提取劑,采用索氏提取法從草蓯蓉(Boschniakia rossica)中提取齊墩果酸、熊果酸和綠原酸,然后用熱水提取法從殘?jiān)刑崛《嗵?。運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸含量進(jìn)行檢測(cè),再運(yùn)用分光光度法對(duì)草蓯蓉多糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,草蓯蓉中含有較豐富的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖,其含量分別為0.586%、0.575%、0.326%、11.835%;回收率分別為96.90%~99.80%、97.20%~100.30%、97.50%~100.20%、94.30%~98.60%;變異系數(shù)分別為1.13%、1.26%、1.10%、1.74%。

      關(guān)鍵詞:草蓯蓉(Boschniakia rossica);高效液相色譜法;齊墩果酸;熊果酸;綠原酸;多糖

      中圖分類號(hào):R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)16-3579-05

      The Extraction and Content Determination of Four Active Components in

      Boschniakia rossica

      DONG Chang-ying,YU Jia-ping

      (College of Bio-engineering, Jilin Agricultural Science and Technology College,Jilin 132101,Jilin,China)

      Abstract: Using 80%(volume fraction) ethanol as solvent, oleanolic acid, ursolic acid and chlorogenic acid were extracted from Boschniakia rossica by soxhlet extraction; then polysaccharide was extracted from the residue by hot water extraction process. The contents of oleanolic acid, ursolic acid and chlorogenic acid were determined by HPLC; and the content of polysaccharide was determined by ultraviolet visible spectrophotometer. The results showed that B. rossica was rich in oleanolic acid, ursolic acid, chlorogenic acid and polysaccharides as the content was 0.586%,0.575%,0.326% and 11.835%, respectively. The recovery was 96.90%~99.80%, 97.20%~100.30%, 97.50%~100.20% and 94.30%~98.60% respectively; while RSD was 1.13%, 1.26%, 1.10% and 1.74%, respectively.

      Key words: Boschniakia rossica; HPLC; oleanolic acid; ursolic acid; chlorogenic acid; polysaccharide

      草蓯蓉(Boschniakia rossica)俗稱不老草,為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物[1],全草可用藥[2,3]。主要分布在中國的北方地區(qū),此外,在日本的富士山區(qū)、朝鮮的北部山區(qū)等地區(qū)也有分布[4]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,草蓯蓉具有補(bǔ)腎壯陽、潤腸止血、滋補(bǔ)強(qiáng)身、延年益壽的功效[5];主要用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎、前列腺炎以及腎臟和膀胱出血等疾?。郏叮荨iL期以來,人們對(duì)其進(jìn)行了大量的科學(xué)研究,取得了很多的研究成果。但主要是對(duì)草蓯蓉的揮發(fā)油和多糖方面的研究比較多,對(duì)藥用價(jià)值極高、生物活性很強(qiáng)的齊墩果酸、熊果酸及綠原酸的研究很少。試驗(yàn)以草蓯蓉為原料,對(duì)其中的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸及多糖進(jìn)行提取和含量測(cè)定,以便于科學(xué)地開發(fā)和充分地利用這一寶貴資源,更好地為社會(huì)服務(wù),為人類造福。

      1材料與方法

      1.1材料

      1.1.1原料草蓯蓉購買于吉林省長春市參茸市場(chǎng),其生長于吉林省延邊朝鮮族自治州,經(jīng)專家鑒定為草蓯蓉,經(jīng)陰干、低溫烘干處理為干品,放于干燥器內(nèi)備用。

      1.1.2試劑甲醇、乙腈(色譜純)購自天津市福晨化學(xué)試劑廠,乙酸、磷酸、無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸和苯酚購自沈陽市新化試劑廠,齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所,葡萄糖購自天津化學(xué)試劑有限公司。

      1.1.3主要儀器島津LC-20A型高效液相色譜儀、Shimadzu島津氣相色譜儀工作站、島津色譜柱(4.6 mm×250.0 mm,5 μm,十八烷基硅烷鍵合硅膠)、島津色譜柱(4.6 mm×150.0 mm,5 μm,十八烷基硅烷鍵合硅膠)購自日本島津株式會(huì)社,UV-1600型記錄式紫外-可見分光光度計(jì)購自北京瑞利分析儀器有限公司,索氏提取器購自上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司,ESJ205-4型電子天平購自沈陽龍騰電子有限公司,101-3型電熱鼓風(fēng)箱購自中國上海第二五金廠,Anke TGI-16B型離心機(jī)購自上海安亭儀器設(shè)備有限公司,RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠,SHB-IIIA型循環(huán)水真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司,XA-1型固體樣品粉碎機(jī)購自江蘇省金壇市恒豐儀器廠。

      1.2方法

      1.2.1溶液的配制

      1)齊墩果酸、熊果酸混合對(duì)照品溶液和綠原酸對(duì)照品溶液的配制。分別精密稱取齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對(duì)照品22.40、20.30和5.80 mg,分別置于25 mL容量瓶中,加甲醇后用超聲波輔助溶解并定容,搖勻。取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品溶液各5 mL,置于10 mL容量瓶中,搖勻。將齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液及綠原酸對(duì)照品溶液用0.25 μm濾膜過濾,濾液即對(duì)照品溶液。齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的濃度分別為0.448、0.406和0.232 mg/mL。

      2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25.00 mg,置于250 mL容量瓶中,用去離子水溶解、定容,搖勻,即得濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

      3)苯酚溶液的配制。?。福?g苯酚,加0.1 g鋁片和0.05 g NaHCO3,蒸餾,收集182 ℃餾分[7]。稱?。?g,加水溶解,定容于100 mL棕色容量瓶中,現(xiàn)配現(xiàn)用。

      1.2.2草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸與多糖的提取

      1)草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的提取。將干燥的草蓯蓉用粉碎機(jī)粉碎,稱?。玻埃埃埃?g,用濾紙包好,置于索氏提取器中,取體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液100 mL,先往索氏提取器中加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液至與虹吸管相平,剩余液體加入圓底燒瓶中,浸泡樣品2 h,然后在水浴鍋上加熱回流至無色,控制溫度在75 ℃左右。把回流液倒入100 mL容量瓶中,超聲波輔助溶解,過濾,定容,所得待測(cè)液放于冰箱中待用。

      2)草蓯蓉中多糖的提取與純化。準(zhǔn)確稱取提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘?jiān)保担埃埃?g,置于500 mL燒杯中,再加去離子水300 mL,在水浴鍋上加熱提取3 h,間歇攪拌,過濾,減壓濃縮至100 mL,用Sevage法[8]除蛋白質(zhì),過濾,將濾液調(diào)至pH 8.0,然后用H2O2法[9]脫色,脫色后用流動(dòng)水透析48 h,透析液加無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,于冰箱中靜置過夜醇沉,再離心分離,沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次,最后真空干燥至恒重,即得精制的草蓯蓉多糖。

      1.2.3檢測(cè)波長和流動(dòng)相的選擇

      1)檢測(cè)齊墩果酸和熊果酸的色譜條件。采用4.6 mm×250.0 mm的島津色譜柱,用十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑,填料粒度為5 μm,流速為0.5 mL/min,柱溫為20 ℃。按齊墩果酸計(jì),理論板數(shù)不低于5 000,按熊果酸計(jì),不低于4 000。選擇最佳的檢測(cè)波長和流動(dòng)相。

      2)檢測(cè)綠原酸的色譜條件。采用4.6 mm×150.0 mm的島津色譜柱,用十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑,填料粒度為5 μm,流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃。按綠原酸峰計(jì)算,理論板數(shù)應(yīng)不低于4 000。選擇最佳的檢測(cè)波長和流動(dòng)相。

      1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      1)齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液5.0、7.0、9.0、10.0、13.0、15.0 μL,進(jìn)樣并記錄色譜圖,以齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo),峰面積積分值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:■齊墩果酸=7.122×10-7x-0.031 5,r=0.999 9;■熊果酸=8.560×10-7x-0.042 1,r=0.999 6。在齊墩果酸進(jìn)樣量為2.24~6.72 μg,熊果酸進(jìn)樣量為2.03~6.09 μg,進(jìn)樣量與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

      2)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0 μL,進(jìn)樣并記錄色譜圖,以綠原酸對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo),峰面積積分值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程■=5.646×10-7x-0.095 75,r=0.999 6。在綠原酸進(jìn)樣量為0.232~3.480 μg,進(jìn)樣量與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

      3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL,依次加去離子水至終體積均為2 mL。另取去離子水2 mL作空白試驗(yàn),每支試管加1 mL 60 g/L苯酚溶液,搖勻。用移液管向每支試管中緩慢加入5 mL濃硫酸,搖勻,放置15 min后置于40 ℃水浴加熱10 min,取出置于冷水中冷卻。在490 nm下測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:■=12.643x-0.031,r=0.999 7。

      1.2.5樣品中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖含量的測(cè)定

      1)草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸含量的測(cè)定。?。保?μL經(jīng)0.25 μm濾膜過濾的草蓯蓉提取液,平行進(jìn)樣5次,得色譜圖,根據(jù)回歸方程計(jì)算草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的含量。

      2)多糖含量的測(cè)定。①換算因子的測(cè)定。準(zhǔn)確稱?。担埃?mg草蓯蓉多糖,加去離子水定容于25 mL容量瓶中。參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法處理后測(cè)定吸光度,按下式計(jì)算換算因子:f=CS/C(CS為多糖的濃度,C為多糖液中葡萄糖的濃度)。計(jì)算得草蓯蓉多糖的換算因子為4.87。②樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘?jiān)埃担埃?0 g,置于200 mL燒杯中,再加去離子水50 mL,在水浴鍋上加熱提取3 h,間歇攪拌,過濾,定容于250 mL容量瓶,?。?mL,參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法處理后測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程求草蓯蓉的葡萄糖含量,再根據(jù)換算因子求得多糖的含量。

      1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取齊墩果酸、熊果酸、綠原酸對(duì)照品溶液和多糖溶液,分別在0、1、2、4、8、12、24 h后測(cè)定齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的峰面積積分值及多糖的吸光度,考察齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對(duì)照品溶液放置后峰面積積分值及多糖吸光度的變化情況。

      1.2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)精密稱取草蓯蓉粉末及提取過齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的草蓯蓉殘?jiān)鳎捣?,分別按1.2.2的方法制備待測(cè)樣品溶液,按1.2.4的方法分析測(cè)定,根據(jù)1.2.5的方法分別計(jì)算齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量。

      1.2.8回收率與精密度試驗(yàn)為了考察方法的可靠性,分別進(jìn)行了回收率和精密度的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取草蓯蓉粉末0.100 g,準(zhǔn)確加入齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖各1.000 mg,按1.2.2的方法提取制備待測(cè)液,按1.2.4的方法分析,計(jì)算得回收率和變異系數(shù)。

      2結(jié)果與分析

      2.1齊墩果酸、熊果酸和綠原酸檢測(cè)波長的選擇

      將齊墩果酸、熊果酸和綠原酸用流動(dòng)相分別配成待測(cè)溶液,用紫外-可見分光光度計(jì)于200~400 nm進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果表明,齊墩果酸和熊果酸在210 nm處均有較強(qiáng)的吸光度,綠原酸在327 nm處有較強(qiáng)的吸光度。因此,檢測(cè)齊墩果酸和熊果酸時(shí)選擇210 nm作為檢測(cè)波長,檢測(cè)綠原酸時(shí)選擇327 nm作為檢測(cè)波長。

      2.2高效液相色譜法流動(dòng)相的選擇

      2.2.1檢測(cè)齊墩果酸和熊果酸的流動(dòng)相的選擇考慮到齊墩果酸和熊果酸均為三萜類化合物,結(jié)構(gòu)非常相似,采用高效液相色譜法也很難將這兩種化合物分離開。因此,在選擇流動(dòng)相時(shí)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,分別用體積比為88∶12的甲醇、水混合液,體積比為70∶10∶20的乙腈、甲醇、水混合液,體積比為94∶6的甲醇、1 g/L乙酸混合液(pH 3.4)等為流動(dòng)相,分別進(jìn)行分析。結(jié)果表明,以體積比為94∶6的甲醇、1 g/L乙酸混合液(pH 3.4)作為流動(dòng)相時(shí),齊墩果酸和熊果酸的分離效果很好。而用其他流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)分離效果很不好。因此,選擇體積比為94∶6的甲醇、1 g/L乙酸混合液(pH 3.4)作為分析的流動(dòng)相。

      2.2.2檢測(cè)綠原酸的流動(dòng)相的選擇考慮到綠原酸為苯丙素類化合物,結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。因此,在選擇流動(dòng)相時(shí)用體積比為88∶12的甲醇、水混合液,體積比為88∶12的乙腈、水混合液,體積比為10∶90的乙腈、5 g/L磷酸混合液等進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,以體積比為10∶90的乙腈、5 g/L磷酸混合液作為流動(dòng)相時(shí)綠原酸分離效果很好,而其他流動(dòng)相分離效果則不佳。因此,選擇體積比為10∶90的乙腈、5 g/L磷酸混合液作為分析的流動(dòng)相。

      2.3草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的檢測(cè)結(jié)果

      取按1.2.1法制得的對(duì)照品溶液5 μL和按1.2.2法制得的經(jīng)過0.25 μm濾膜過濾的提取液5 μL,按1.2.3色譜條件分別進(jìn)樣分析,平行進(jìn)樣5次,得色譜圖,如圖1所示。由圖1可知,齊墩果酸、熊果酸和綠原酸對(duì)照品的保留時(shí)間分別是17.737、18.892和10.750 min,草蓯蓉提取液的色譜圖中有3個(gè)色譜峰,它們的保留時(shí)間分別是17.703、18.849和10.680 min,根據(jù)在相同的色譜條件下保留時(shí)間相同的色譜峰是相同組分的原理可知,草蓯蓉中含有齊墩果酸、熊果酸和綠原酸。

      2.4草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量

      經(jīng)過測(cè)定得到草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的含量分別為0.586%、0.575%、0.326%和11.835%。如表1至表4所示。

      2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

      齊墩果酸、熊果酸和綠原酸的峰面積及多糖的吸光度的變異系數(shù)分別為0.47%、0.25%、0.58%和0.15%,表明它們?cè)冢玻?h內(nèi)穩(wěn)定。

      2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

      齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的變異系數(shù)分別為1.63%、1.78%、1.53%和2.73%,說明重現(xiàn)性較好。

      2.7回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果

      為了考察方法的可靠性,分別進(jìn)行了回收率和精密度的測(cè)定,結(jié)果如表1至表4所示。由表1至表4可知,齊墩果酸加標(biāo)回收率為96.90%~99.80%,變異系數(shù)為1.13%;熊果酸加標(biāo)回收率為97.20%~100.30%,變異系數(shù)為1.26%;綠原酸加標(biāo)回收率為97.50%~100.20%,變異系數(shù)為1.10%;多糖加標(biāo)回收率為94.30%~98.60%,變異系數(shù)為1.74%。由此可見,該分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

      3結(jié)論

      由試驗(yàn)結(jié)果可知,草蓯蓉中含有較豐富的藥物活性很強(qiáng)的齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖,其含量分別是0.586%、0.575%、0.326%和11.835%。此數(shù)據(jù)可為草蓯蓉藥用價(jià)值的進(jìn)一步科學(xué)開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

      試驗(yàn)方法操作簡單,檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠,是一種可行性較高的檢測(cè)方法,可作為草蓯蓉中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸和多糖的檢測(cè)方法。

      參考文獻(xiàn):

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