基于化學(xué)計(jì)量學(xué)和COX-2抑制活性篩選紅樹共生放線菌中防治藥源性聽力損失成分

摘要：目的 利用代謝組學(xué)技術(shù)和藥源性聾細(xì)胞模型尋找紅樹共生放線菌鏈霉菌屬Streptomyces sp.（No. 1624117）代謝產(chǎn)物中防治藥源性聽力損失成分。方法 從菌株粗提物中篩選具有抗炎活性的極性分段樣，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）對(duì)菌株粗提物和活性分段樣的化學(xué)成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；通過(guò)主成分分析法（PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析法（OPLS-DA）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選差異成分；經(jīng)過(guò)柱層析和高效液相色譜（HPLC）定點(diǎn)分離目標(biāo)差異點(diǎn)，利用核磁和質(zhì)譜鑒定結(jié)構(gòu)；最后通過(guò)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型考察化合物對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果 代謝組學(xué)分析有38個(gè)差異代謝物，結(jié)合抗炎活性測(cè)定結(jié)果，分離純化出6個(gè)化學(xué)成分并確定了結(jié)構(gòu)。在順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型中，化合物1，2，3，4和6均顯示出對(duì)耳蝸毛細(xì)胞具有保護(hù)作用。結(jié)論 本研究建立了一種基于代謝組學(xué)技術(shù)挖掘放線菌代謝產(chǎn)物中防治藥源性聽力損失成分的方法，為尋找防治聽力損失活性化合物提供了新途徑。

關(guān)鍵詞：共生放線菌；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學(xué)；炎癥；藥源性聽力損失

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening of components from a mangrove symbiotic actinomycete against drug-induced hearing loss based on chemometrics and COX-2 inhibition activity

Xiao Suping1， Qian Jinhua2， Wen Dingsheng1， Xu Yuan1， Chen Gang3， Zhang Ming2， and Wen Lu1

（1 School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006; 2 Guangdong Sunho Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhongshan 528437; 3 Center for Drug Research and Development， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006）

Abstract Objective Metabolomics technology and a drug-induced cell injury model of hearing loss were used to screen the metabolites of the mangrove-derived actinomycete Streptomyces sp. （no. 1624117）. Methods Polar segmental samples with anti-inflammatory activity were screened from the crude extract of strain 1624117， and collected by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS）. The metabolic profiles and chemical compositions were clustered differently by multivariate statistical techniques such as principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA）， and their differential chemical compositions were explored. The target compounds were isolated by column chromatography and semi-preparative HPLC， identified by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. Finally， a cisplatin induced HEI-OC1 cell injury model was used to investigate the protective effect of the compounds on cochlear hair cells. Results The UPLC characteristic spectrum of Streptomyces sp. （no. 1624117） was established to identify 38 differential markers， respectively. Six compounds were identified based on the results of their anti-inflammatory activity， and their structures were determined. In the cisplatin induced HEI-OC1 cell injury model， all compounds showed protective effects on cochlear hair cells except compound 5. Conclusion In this study， a metabolomic method was established to mine drug-induced hearing loss components from actinomycetes metabolites， which provided a new way to search for active compounds for the prevention and treatment of hearing loss.

Key words Symbiotic actinomycetes; Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Metabolomics; Inflammation; Drug-induced hearing loss

聽力損失（亦稱“耳聾”）是目前世界上最普遍的感覺障礙之一。耳毒性藥物、噪聲、感染性疾病、衰老或先天遺傳等都會(huì)導(dǎo)致聽力損失，其中因藥物毒性作用致聾者約占總數(shù)的1/3，因此藥物的耳毒性越來(lái)越多地受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[1]。哺乳動(dòng)物的內(nèi)耳是一種高度專業(yè)化的感覺器官，毛細(xì)胞是內(nèi)耳中重要的功能細(xì)胞，在正常情況下能將聲音產(chǎn)生的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并經(jīng)聽覺神經(jīng)傳遞到中樞， 從而產(chǎn)生聽覺。耳毒性藥物會(huì)導(dǎo)致聽覺毛細(xì)胞的損傷，并且毛細(xì)胞無(wú)法自發(fā)修復(fù)或再生，最終導(dǎo)致不可逆的聽力損失[2]。順鉑是臨床常見的化療藥物，對(duì)腫瘤患者具有良好的治療效果，但同時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重的聽力損失。2022年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)也是迄今為止唯一一個(gè)藥品——硫代硫酸鈉作為順鉑誘導(dǎo)聽力損失的治療劑[3]。因此，針對(duì)藥源性耳聾的機(jī)制研究和內(nèi)耳保護(hù)藥物的探索具有重要的臨床意義。

研究表明，耳蝸炎癥是順鉑導(dǎo)致永久性聽力損失的重要因素[4]。炎癥可導(dǎo)致微血管損傷和動(dòng)脈粥樣硬化造成缺血，且循環(huán)的炎癥因子對(duì)耳蝸脈管系統(tǒng)有害，在耳蝸中供血的是單一微血管迷路動(dòng)脈，減少順鉑誘導(dǎo)的炎癥能有效防治聽力損失[5]。環(huán)氧合酶-2（COX-2）是參與炎癥過(guò)程的一種重要酶，也是催化花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶[6]。研究表明，順鉑會(huì)增加COX-2在耳蝸中表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）下游靶點(diǎn)的水平，促使耳蝸毛細(xì)胞凋亡從而誘發(fā)聽力損失，抑制COX-2可有效減少毛細(xì)胞凋亡[7]。因此，以抑制COX-2活性為切入點(diǎn)有望成為挖掘防治藥源性聽力損失活性成分的有效途徑。

紅樹林是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)陸地和海洋過(guò)渡帶的一種耐鹽植物。位于南海海岸的湛江市有著我國(guó)紅樹林面積最大的自然保護(hù)區(qū)，蘊(yùn)藏著多種生物資源。為適應(yīng)高溫、高鹽、低氧和強(qiáng)光照的特殊生境帶來(lái)的巨大壓力，紅樹林形成了復(fù)雜而獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，并創(chuàng)造出極為豐富又極具特色的微生物資源[8]。紅樹共生放線菌具有代謝途徑獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已從中發(fā)現(xiàn)大量抗炎活性成分，揭示了我國(guó)南海紅樹共生放線菌具有極大的藥用開發(fā)前景[9-10]。本研究通過(guò)COX-2抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)，從紅樹共生放線菌鏈霉菌屬Streptomyces sp.（no. 1624117）次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選有抗炎活性的極性分段樣；利用代謝組學(xué)技術(shù)包括主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA），從7個(gè)抗炎活性分段樣代謝輪廓的偏移找出放線菌1624117的差異點(diǎn)；進(jìn)而通過(guò)柱層析和制備HPLC定點(diǎn)分離獲得6個(gè)化合物，結(jié)合核磁共振（NMR）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）確定了所有化合物的結(jié)構(gòu)；通過(guò)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型測(cè)定6個(gè)化合物防治藥源性聽力損失活性，驗(yàn)證了方法的可靠性，為基于代謝組學(xué)手段尋找新型防治藥源性聾天然產(chǎn)物提供了新思路。

1 材料和儀器

1.1 試劑

色譜純甲醇（美國(guó)Merck公司）；柱層析硅膠（200-300目，青島海洋化工有限公司）；塞來(lái)昔布（美國(guó)Sigma公司）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，美國(guó)Sigma公司）；順鉑（CDDP，美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四唑溴化銨（MTT，美國(guó)Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Thermo公司）；COX-2抑制劑篩選試劑盒（美國(guó)Cayman Chemical公司）；UPLC-MS所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

ACQUITY超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；LC-10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Bruker 500 MHz核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；LCQ-DECA-XP質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TOP-870數(shù)控超凈工作臺(tái)（廣潔凈化設(shè)備有限公司）；TCYQ搖床（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；YM75立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械設(shè)備有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g/L、KNO3 1.0 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂

20 g/L，pH 7.2。用于放線菌的保藏。

ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物4.0 g/L、麥芽提取物10.0 g/L、葡萄糖4.0 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用，蒸餾水定容至

1 L。用于放線菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵。

1.4 菌株來(lái)源

放線菌1624117分離自廣東省湛江市紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的Phasolosma esculenta樣品，經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用16S rRNA基因序列鑒定，該菌株確定為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），由改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基保藏在廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院。

2 方法

2.1 菌株發(fā)酵及次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取

從改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基挑取菌株1624117接種到含100 mL ISP2液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，

28 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d，取5 mL種子液轉(zhuǎn)接到

200 mL ISP2液體培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，于28 ℃、200 r/min發(fā)酵14 d，共發(fā)酵100 L。發(fā)酵液在55 ℃水浴中濃縮，3500 r/min離心20 min得濃縮液。濃縮液用兩倍體積乙酸乙酯萃取3次后，減壓濃縮合并萃取液得到36 g粗提物。粗提物依次使用石油醚/乙酸乙酯（90：10，70：30，50：50，30：70，0：100，V/V），乙酸乙酯/甲醇（50：50，0：100，V/V）進(jìn)行硅膠色譜層析分離，得到極性分段樣1～12。

2.2 抑制COX-2活性的測(cè)定

精密稱取凍干的粗提物及極性分段樣各5 mg，加1 mL DMSO溶解配成母液，加入PBS制成20 mg/mL

溶液，即得樣品。按照COX-2抑制劑篩選試劑盒說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行活性篩選，設(shè)置空白組、陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組，每組設(shè)置復(fù)孔3個(gè)，塞來(lái)昔布為陽(yáng)性對(duì)照，具體操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在405 nm處讀取吸光度（A值），并計(jì)算每個(gè)樣品的抑制率。

抑制率（%）=（X100%酶活性對(duì)照－X樣品組）/（X100%酶活性對(duì)照－X空白組）。

2.3 UPLC-MS指紋圖譜的建立

精密稱取放線菌1624117極性分段樣凍干粉適量，加甲醇溶解，配制成濃度為20 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。電噴霧離子源（ESI），采用正負(fù)離子模式掃描，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 100～1000。參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓，3 kV；取樣錐孔電壓，30 V；離子源溫度，100 ℃；脫溶劑氣溫度，350 ℃；霧化氣（N2）流速，60 L/h；脫溶劑氣（N2）流速，600 L/h；碰撞能量（CE），10～40 eV。

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×

2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）。梯度洗脫程序：0～3.8 min，10% B；3.8～

21.8 min，10%～90% B；21.8～25.8 min，90%～100% B；25.8～26.8 min，100% B；流速：0.208 mL/min。進(jìn)樣量5 μL，柱溫箱30 ℃。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將UPLC-MS采集的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx V4.1中進(jìn)行數(shù)據(jù)基線過(guò)濾和校準(zhǔn)、峰提取、峰校準(zhǔn)、峰識(shí)別和歸一化等一系列數(shù)據(jù)預(yù)處理，得到包括質(zhì)荷比m/z、保留時(shí)間和峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP 14.1（Umetrics，瑞典）進(jìn)行多維建模分析。無(wú)監(jiān)督的PCA對(duì)各組的總體代謝分布情況進(jìn)行考察，有監(jiān)督的OPLS-DA進(jìn)一步篩選組間差異較大的生物標(biāo)志物。依據(jù)變量對(duì)分組貢獻(xiàn)得分（VIPgt;1）和組間變化的差異檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)）顯著性（Plt;0.05）為差異性代謝產(chǎn)物的篩選標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.5 目標(biāo)化合物的分離與鑒定

PCA和OPLS-DA分析所得差異代謝物，結(jié)合極性分段樣抗炎活性結(jié)果，確定目標(biāo)化合物。根據(jù)目標(biāo)離子的保留時(shí)間和質(zhì)荷比，運(yùn)用柱色譜層析和半制備HPLC對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定點(diǎn)分離，利用NMR和ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.6 化合物對(duì)CDDP誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

HEI-OC1細(xì)胞是從小鼠耳蝸中分離并構(gòu)建的永生化毛細(xì)胞，可特異性表達(dá)耳蝸毛細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物，是一種用于篩選藥物潛在耳毒性或耳保護(hù)特性的體外系統(tǒng)[12]。參考課題組前期建立的方法[13]，

在96孔板中分別設(shè)置對(duì)照組、模型組（40 μmol/L CDDP）、陽(yáng)性藥組（1 mmol/L NAC）、待測(cè)組（濃度分別為10，20和40 μmol/L）、空白組（DMSO）。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEI-OC1細(xì)胞制成懸液，以1×105 /mL的濃度在96孔板每孔加入100 μL，孵育12 h。分別于每孔加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)基（對(duì)照組和模型組），100 μL NAC（陽(yáng)性藥組）或100 μL目標(biāo)化合物（待測(cè)組），預(yù)處理1 h后，空白組加入100 μL

高糖DMEM培養(yǎng)基，其他組加入100 μL CDDP，共孵育24 h后棄去藥液，再向每孔加入100 μL MTT

（0.5 mg/mL）繼續(xù)孵育4 h。棄去MTT，每孔加入

100 μL DMSO，將96孔板置于37 ℃恒溫振蕩箱中，以100 r/min的速度振搖10 min后使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取A值，將對(duì)照組平均A值視為存活率100%，A值越大說(shuō)明化合物的細(xì)胞保護(hù)作用越強(qiáng)。使用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 放線菌1624117粗提物及其分段樣對(duì)COX-2活性的抑制作用

放線菌1624117粗提物（A0）利用硅膠柱層析分離得到12個(gè)分段樣，極性從小到大編號(hào)為A1、A2、A3、B4、B5、B6、C7、C8、D9、D10、D11和E12。COX-2抑制劑篩選試劑盒活性測(cè)定結(jié)果顯示，放線菌1624117粗提物的COX-2抑制率為92.75%，各分段樣的活性有明顯差異，樣品A2（68.01%）和C7（67.11%）抑制率較大，樣品B4（26.98%），B5（20.03%），C8（23.86%）和D9（8.04%）抑制率較?。▓D1）。

3.2 放線菌1624117粗提物UPLC-MS結(jié)果

采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)放線菌1624117粗提物進(jìn)行檢測(cè)，正、負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖（TIC）見圖2。從圖中可以看出各組樣本代謝輪廓存在明顯差異，正離子模式下響應(yīng)值較高。低極性成分較多，主要集中在保留時(shí)間16.0～26.7 min。

3.3 PCA和OPLS-DA分析

選取高活性的放線菌1624117粗提物（編號(hào)定為XY-1）以及活性差異大的6個(gè)分段樣，包括高活性A2和C7，低活性B4、B5、C8和D9作為測(cè)試樣品（編號(hào)為XY-2～XY-7），每個(gè)樣品隨機(jī)采集2次數(shù)據(jù)，剔除1個(gè)無(wú)效數(shù)據(jù)，實(shí)際參與分析的數(shù)據(jù)量為13個(gè)。因UPLC-MS結(jié)果中正離子模式下響應(yīng)值較高，故僅考察正離子模式下的模型。將MassLynx V4.1處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log transform和UV scaling處理，然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析。使用無(wú)監(jiān)督的PCA評(píng)估樣本的分類趨勢(shì)和組間差異，可看出參與分析的樣本全部處于95%橢圓形置信區(qū)內(nèi)，無(wú)異常數(shù)據(jù)點(diǎn)；同組間兩個(gè)樣本點(diǎn)距離較近，不同組間分布有明顯的分離趨勢(shì)，說(shuō)明所含化學(xué)成分存在一定差異（圖3）。此外，當(dāng)模型概括X矩陣解釋率R2Xgt;0.4時(shí)說(shuō)明該模型可靠，本實(shí)驗(yàn)中生成的PCA模型的質(zhì)量參數(shù)R2X=0.778，因此所建立的模型可以很好地解釋各組間差異。

PCA多用于考察樣本之間相關(guān)性，還需要應(yīng)用有監(jiān)督的OPLS-DA進(jìn)一步進(jìn)行二維數(shù)據(jù)分析，可以通過(guò)正交化篩選數(shù)據(jù)信息中與類別信息無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)，去除PCA中無(wú)關(guān)的差異信息，從而更加精準(zhǔn)地篩選出各類樣本的特征變量[14]。OPLS-DA分析以變量重要性為依據(jù)進(jìn)行差異代謝物篩選，更能把握多位數(shù)據(jù)整體特征和變異規(guī)律[15]。如圖4A所示，在95%置信區(qū)間內(nèi)，OPLS-DA模型顯示的可接受值為R2X（0.782）、R2Y（0.971）和Q2（0.965），高活性樣本組XY-1、XY-2和XY-5落在右側(cè)t[1]值較大且為正數(shù)的區(qū)域，低活性樣本組XY-3、XY-4、XY-6和XY-7則落在坐標(biāo)軸左側(cè)，提示該模型對(duì)組間樣本有良好的區(qū)分度，各分段樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物存在差異。為防止模型過(guò)擬合，采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（response permutation testing，RPT）的方法來(lái)考察模型的質(zhì)量。由七次循環(huán)交互驗(yàn)證的方差分析可知P= 3.951×10-4lt;

0.01，達(dá)顯著水平，說(shuō)明該模型充分提取了不同樣本間的差異信息，預(yù)測(cè)性能力強(qiáng)。RPT是一種用來(lái)評(píng)價(jià)OPLS模型準(zhǔn)確性的隨機(jī)排序方法，用來(lái)避免監(jiān)督性學(xué)習(xí)方法獲得分類不是偶然的。建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA模型以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值，與原模型的R2Y、Q2Y進(jìn)行線性回歸，得到的回歸直線與y軸的截距值分別為R2和Q2，如圖4B所示，R2Y和Q2Y直線的斜率均大于0，不存在過(guò)度擬合，模型穩(wěn)健性良好，可用于組間代謝物的差異分析。

3.4 差異代謝物分析

為進(jìn)一步分析具體的差異物質(zhì)，采用載荷圖（loading圖）和S型曲線圖（S-plot）標(biāo)識(shí)差異代謝物。在載荷圖（圖5A）中，接近于-0.1或0.1的載荷表明變量對(duì)分組影響越強(qiáng)，紅色點(diǎn)代表的物質(zhì)對(duì)分組影響較強(qiáng)，藍(lán)色點(diǎn)代表的物質(zhì)對(duì)分組的影響很弱。S型曲線圖（圖5B）中，數(shù)據(jù)點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，則該變量對(duì)樣本分組差異的貢獻(xiàn)越大，因此，越靠近右上角和左下角的代謝物（紅色點(diǎn)）表示其差異越顯著，是組間差異標(biāo)志物。OPLS-DA分析中，變量權(quán)重值VIP可用來(lái)衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，VIP越大，說(shuō)明該變量對(duì)分組的貢獻(xiàn)越大，從而挖掘具有生物意義的差異代謝物。每個(gè)樣本對(duì)OPLS-DA模型的貢獻(xiàn)都按VIP進(jìn)行排序，以VIPgt;2.5為閾值進(jìn)行篩選，共得到38個(gè)差異變量。

3.5 目標(biāo)化合物的分離與鑒定

結(jié)合各極性分段樣的COX-2抑制活性測(cè)定結(jié)果，對(duì)38個(gè)差異變量進(jìn)行分析篩選，從中尋找出高活性極性分段樣與低極性分段樣高含量差異代謝物，最終確定6個(gè)化學(xué)成分，依次對(duì)應(yīng)色譜峰保留時(shí)間為9.12，16.29，20.36，21.56，23.08和26.75 min，

這些成分是放線菌1624117次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有COX-2抑制活性的極性分段樣中主要標(biāo)志性成分。極性分段樣先經(jīng)柱色譜分離，再使用Ultimate C18制備色譜柱（250 mm×10.0 mm，10 μm）上HPLC純化，最后通過(guò)NMR和ESI-MS測(cè)定，與文獻(xiàn)對(duì)照后確定結(jié)構(gòu)[16-21]，結(jié)果見表1。

化合物1：白色晶體，ESI-MS m/z：211.2 [M+H]+，分子式為C11H18O2N2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 6.80 （1H， s， NH）， 4.07 （1H， t， J=8.0 Hz， H-6）， 3.96 （1H， dd， J=4.0， 12.0 Hz， H-9）， 3.55 （1H， m， H-3a）， 3.49 （1H， m， H-3b）， 2.29 （1H， m， H-5a）， 2.07 （1H， m， H-5b）， 2.00 （1H， m， H-10）， 1.95 （2H， m， H-4a， 4b）， 1.49 （1H， m， H-11a）， 0.95 （3H， d， J=4.0 Hz， H-12）， 0.91 （3H， m， H-13）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 170.7 （C-1）， 165.2 （C-7）， 60.6 （C-6）， 58.8 （C-9）， 45.1 （C-3）， 35.4 （C-11）， 29.6 （C-5）， 24.0 （C-10）， 22.4 （C-4）， 15.7 （C-12）， 12.1 （C-13）。

化合物2：無(wú)色晶體，ESI-MS m/z：165.1 [M-H]-，分子式為C9H10O3。1H NMR （500 MHz， CD3OD-d4） δH： 7.20 （5H， m， Ar-H）， 4.33 （1H， dd， J=4.0， 8.0 Hz， H-2）， 3.10 （1H， dd， J=4.0， 12.0 Hz， H-3）， 2.90 （1H， dd， J=8.0， 12.0 Hz， H-3）。13C NMR （125 MHz， CD3OD-d4） δC： 177.2 （C-1）， 138.9 （C-1'）， 130.6 （C-2'， 6'）， 129.2 （C-3'， 5'）， 127.5 （C-4'）， 72.8 （C-2）， 41.6 （C-3）。

化合物3：白色晶體，ESI-MS m/z 271.1 [M+H]+，293.1 [M+Na]+，分子式為C15H10O5。1H NMR （500 MHz， CD3OD-d4） δH： 8.05 （1H， s， H-2）， 7.37 （2H， d， J=8.0 Hz， H-2'， 6'）， 6.85 （2H， d， J=8.0 Hz， H-3'， 5'）， 6.35 （1H， d， J=4.0 Hz， H-8）， 6.23 （1H， d， J=4.0 Hz， H-6）。13C NMR （125 MHz， CD3OD-d4） δC： 154.8 （C-2）， 123.3 （C-3）， 182.3 （C-4）， 163.9 （C-5）， 100.1 （C-6）， 166.0 （C-7）， 94.8 （C-8）， 158.8 （C-9）， 106.3 （C-10）， 124.8 （C-1'）， 131.4 （C-2'， 6'）， 116.3 （C-3'， 5'）， 159.7 （C-4'）。

化合物4：白色固體，ESI-MS m/z：255，[M+H] +，

分子式為C16H30O2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 3.59 （1H， m， H-4）， 2.34 （2H， t， J=8.0 Hz， H-1）， 1.63 （2H， m）， 1.43 （4H， s）， 1.30 （18H， m）， 0.88 （3H， t， J=8.0 Hz）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 178.5 （C-2）， 72.2 （C-1）， 37.6 （C-4）， 34.0 （CH2）， 32.0 （CH2）， 29.7 （CH2）， 29.5 （CH2）， 29.3 （2CH2）， 29.1 （2CH2）， 25.8 （CH2）， 25.7 （CH2）， 24.8 （CH2）， 22.8 （CH2）， 14.2 （CH3）。

化合物5：白色固體，EI-MS m/z：256[M] +，分子式為C16H32O2。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 2.34 （2H， t， J=8.0 Hz， H-2）， 1.63 （2H， m， H-3）， 1.25 （24H， m， H-4～15）， 0.88 （3H， t， J=8.0 Hz， H-16）。13C NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 179.4 （C-1）， 34.1 （C-2）， 32.1 （C-3）， 29.8 （C-4～8）， 29.7 （C-9）， 29.6 （C-10）， 29.5 （C-11）， 29.4 （C-12）， 29.2 （C-13）， 24.8 （C-14）， 22.8 （C-15）， 14.3 （C-16）。

化合物6：白色固體，ESI-MS m/z：243[M-H]-，分子式為C14H28O3。1H NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 3.96 （1H， m， H-3）， 2.44 （1H， dd， J=8.0， 4.0 Hz， H-2a）， 2.36 （1H， dd， J=8.0， 4.0 Hz， H-2b）， 1.47 （2H， s， H-4）， 1.30 （18H， s， H-5～13）， 0.90 （3H， t， J=8.0 Hz， H-14）。13C NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 175.8 （C-1）， 69.6 （C-3）， 43.7 （C-2）， 38.1 （C-4）， 33.1 （C-5）， 30.8 （C-6）， 30.7 （C-7～9）， 30.5 （C-10）， 26.7 （C-11， 12）， 23.7 （C-13）， 14.4 （C-14）。

3.6 化合物對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

在順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷模型中，與模型組相比，化合物1，2，3，4和6分別在40，40，10，10和10 μmol/L使細(xì)胞存活率顯著提高（Plt;0.05），化合物3在較高濃度（40 μmol/L）時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性。因此，通過(guò)COX-2抑制活性篩選所得化合物，也能夠有效減輕順鉑引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷（圖7）。

4 討論

本研究利用COX-2抑制活性實(shí)驗(yàn)篩選放線菌1624117粗提物中有效的極性分段樣，并建立UPLC-MS總離子流色譜圖，結(jié)合PCA和OPLS-DA分析確定差異代謝物，通過(guò)定點(diǎn)識(shí)別與分離，從放線菌1624117粗提物中獲得6個(gè)化合物，并通過(guò)NMR和ESI-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。首次發(fā)現(xiàn)化合物1，2，3，4和6對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，具有潛在的防治順鉑耳毒性效果。

炎癥和氧化應(yīng)激是順鉑耳毒性的兩個(gè)主要機(jī)制[22]。順鉑產(chǎn)生炎癥導(dǎo)致聽力損失的過(guò)程是通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[23]。已有的研究表明所得6個(gè)化合物中，化合物1為環(huán)二肽類化合物，具有兩個(gè)氫供體和氫受體，表現(xiàn)出較高的與酶或蛋白質(zhì)結(jié)合的潛力[24]?；衔?為芳香烴衍生物，通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平發(fā)揮消除炎癥的作用[25]?；衔?屬于異黃酮類化合物，已發(fā)現(xiàn)可以恢復(fù)抗氧化酶活性[26]，并通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α分泌來(lái)減輕炎癥[27]，推測(cè)化合物3通過(guò)抗氧化減少順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基，抑制TNF-α等兩種以上的途徑實(shí)現(xiàn)防治藥源性聽力損失。此外，研究表明G蛋白耦聯(lián)受體在耳保護(hù)中起著重要作用[28]，化合物6為羥基脂肪酸類化合物，可能通過(guò)激活G蛋白耦聯(lián)受體發(fā)揮生物活性[29]。化合物4是內(nèi)酯類化合物，在細(xì)胞內(nèi)容易被水解成羥基脂肪酸[30]，轉(zhuǎn)化為和6同類型化合物?；衔?也是脂肪酸類化合物但沒有活性，結(jié)合化合物6的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推測(cè)脂肪酸結(jié)構(gòu)中羧基旁羥基的存在對(duì)活性起到重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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