HPLC-MS-MS法測定克拉霉素血藥濃度的含量

卞寶軍+丁禮琴+金家驊

摘 要 建立一種用高效液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜（HPLC-MS-MS）聯(lián)用技術(shù)測定克拉霉素血藥濃度的方法。以甲醇-水（1%甲酸溶液）-乙腈（80∶10∶10）為流動(dòng)相，羅紅霉素甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)C18柱分離后，以質(zhì)譜為檢測器，采用選擇性離子檢測（SIM）測定人體血漿中克拉霉素的含量。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 克拉霉素 血藥濃度

中圖分類號：R927.11； O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1006-1533（2016）21-0076-04

Determination of clarithromycin in human plasma by HPLC-MS-MS

BIAN Baojun*， DING Liqin， JIN Jiahua**（Shanghai Zhonghua Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT To establish a method for the determination of clarithromycin in human plasma by HPLC-MS-MS. The plasma samples were separated by C18 column and detected by the selective ion monitoring （SIM） with methanol-water （1% formic acid solution） -acetonitrile （80：10：10） as a mobile phase， methanol solution of roxithromycin as an internal standard and the mass spectrometer as a detector.

KEY WORDS HPLC-MS-MS； clarithromycin； plasma concentration

克拉霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，本公司產(chǎn)品為克拉霉素膠囊劑。為增加該品的溶出度，變更了輔料以及制備工藝，故擬進(jìn)行新制劑的生物等效性評價(jià)。由于克拉霉素基本無紫外吸收，故本研究參照文獻(xiàn)[1-5]，并作適當(dāng)修改后，采用高效液相-二級質(zhì)譜法測定血漿中克拉霉素的濃度。我們對HPLC-MS-MS法測定克拉霉素血藥濃度的方法學(xué)進(jìn)行了研究，并測定了18名健康志愿者口服克拉霉素膠囊后的血藥濃度，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

API 3000液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ABI公司，包括：Agilent 1100 G1367A自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent 1100 G1311A泵；Agilent 1100 G1316A柱溫箱；API3000質(zhì)譜儀及Analyst 1.4軟件）。XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Millipore A超純水系統(tǒng)。

克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品（每毫克相當(dāng)于972單位）和內(nèi)標(biāo)羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品（每毫克相當(dāng)于952單位），均由中國藥品生物制品檢定所提供；參比制劑為本公司生產(chǎn)的克拉霉素膠囊（每粒膠囊含克拉霉素250 mg），試驗(yàn)制劑1和2為經(jīng)過變更藥用輔料和生產(chǎn)工藝后本公司生產(chǎn)的克拉霉素膠囊（每粒膠囊分別含克拉霉素250 mg和125 mg）；甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸為分析純。

1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1）色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-水 （1%甲酸溶液）-乙腈（80∶10∶10）；柱溫：25 ℃；流速： 0.2 ml/min；進(jìn)樣量：2.5 μl；預(yù)柱：C18（ODS）（Phenomenex）。

2）質(zhì)譜條件 掃描類型：MRM positive 選擇性正離子檢測；離子源：Turbo spray；電離模式：ESI；霧化氣流速：8 L/min；Curtain gas：8 L/min；碰撞氣流速：4 L/min；噴霧針電壓：5 000 v；離子源溫度：450 ℃。

1.3 克拉霉素和羅紅霉素溶液的配制

精密稱取克拉霉素對照品102.9 mg，用甲醇溶解并稀釋成1 mg/ml 的溶液，再經(jīng)系列稀釋制備成0.2、 1、2、10、20和50 μg/ml 的克拉霉素對照溶液。所有溶液均在4 ℃條件下避光保存。

精密稱取羅紅霉素對照品10.5 mg，用甲醇溶解并稀釋成含羅紅霉素0.5 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4 血樣預(yù)處理

精密吸取受試者血漿0.3 ml ，置于1.5 ml 離心管內(nèi)，加入0.9 ml 蛋白沉淀劑，旋渦振蕩2 min后，16 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 μl進(jìn)樣分析。

1.5 方法學(xué)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取健康人空白血漿若干份，分別加入克拉霉素對照溶液，使其濃度分別為 10、50、100、500、1 000和2 500 ng/ml ，按“血樣預(yù)處理”項(xiàng)下處理后進(jìn)行HPLC-MS-MS分析。

以藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對藥物濃度（C，ng/ml），用線性回歸方法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線（加權(quán)系數(shù)為1/C2），得回歸方程為Y=0.006 695 C+ 0.006 649（r=0.998 5，n=6），線性范圍為10～2 500 ng/ml，最低檢測限為 5 ng/ml（S/N >10）。

1.5.2 質(zhì)控點(diǎn)血樣處理

按血樣預(yù)處理方法操作，分別配制含10、500和2 500 ng/ml的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)血樣，每一濃度配制3份，按血樣預(yù)處理方法處理后進(jìn)行HPLC-MS-MS分析，作為質(zhì)量控制。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差應(yīng)小于15%，低濃度偏差應(yīng)小于20%。

1.5.3 絕對回收率

用流動(dòng)相配制10 、100、2 500 ng/ml 的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按血樣預(yù)處理方法處理后進(jìn)行HPLC-MS-MS分析，分別求得克拉霉素的峰面積（A1）；按照1.5.2方法配制含血樣的上述濃度的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液作HPLCMS-MS分析，分別求得克拉霉素的峰面積（A2）。將A2/A1即為絕對回收率。

配制上述濃度的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)血樣各5管，按血樣預(yù)處理方法處理后的樣品進(jìn)行HPLC-MS-MS分析，計(jì)算測定數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差，即為批內(nèi)精密度。以后連續(xù)5 d，每天測定一個(gè)批次內(nèi)的上述各濃度樣品，計(jì)算批間精密度。

1.5.4 樣品穩(wěn)定性考察

將上述克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)血樣，放置在-20 ℃的冰箱中，分別于第0天和第40天取樣分析，考察其長期存放的穩(wěn)定性。將放置在-20 ℃冰箱中的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)血樣，反復(fù)凍融3次后測定其濃度，考察其凍融穩(wěn)定性。將上述經(jīng)血樣預(yù)處理后的克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)血樣即時(shí)或在室溫放置24 h后取樣進(jìn)行HPLC-MS-MS分析，記錄峰面積比值，考察樣品在預(yù)處理后的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 絕對回收率

絕對回收率的結(jié)果見表1。

2.2 批內(nèi)、批間精密度

批內(nèi)、批間精密度的結(jié)果見表2、3。

2.3 樣品穩(wěn)定性

本研究配制的樣品在-20 ℃的冰箱中至少能保存40 d仍穩(wěn)定（表4），反復(fù)凍融3次及在室溫保存24 h后血藥濃度無明顯變化（表5、6）。

2.4 試驗(yàn)制劑和參比制劑血藥濃度平均值—時(shí)間曲線

18名男性健康受試者隨機(jī)分成3組，采用三制劑三周期二重3×3拉丁方交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)[6]的給藥方案，分別單劑量口服試驗(yàn)制劑或參比制劑250 mg，在一定時(shí)間點(diǎn)抽取靜脈血，采用HPLC-MS-MS測定克拉霉素的血藥濃度，結(jié)果表明試驗(yàn)制劑1和2與參比制劑生物等效[7]（圖1）。

3 討論

測定正常人體內(nèi)克拉霉素的血藥濃度通常多采用微生物法[8-9]，該方法測定的并非克拉霉素單一組分，而是所有具有抗菌活性的多組分復(fù)合物；亦有采用HPLC-UV方法[10-11]，紫外最大吸收波長約為210 nm，在此波長下血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較多，其測定結(jié)果不夠精確。目前國內(nèi)有關(guān)克拉霉素HPLC法血樣處理方法，都采用有機(jī)溶劑如苯、乙醚、乙酸乙酯等液-液萃取，亦有采用小柱活化[12-13]，雙蒸水洗脫，甲醇過柱，過程繁瑣、復(fù)雜，而且樣品受雜峰干擾大，最終影響到樣品檢定的精密度和準(zhǔn)確度。本研究建立了測定人血漿中克拉霉素的HPLC-MS-MS檢測方法，該方法預(yù)處理簡單、快速，專屬性強(qiáng)且靈敏、準(zhǔn)確，最低檢測限度為5 ng/ml，應(yīng)用此方法測定樣品均能得到很好的結(jié)果，尤其適合于幾乎沒有紫外吸收的藥物克拉霉素的血藥濃度測定，能夠滿足人體藥代動(dòng)力學(xué)研究需要。

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