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    注射用頭孢曲松鈉動物體內(nèi)藥代動力學(xué)和相對生物利用度研究

    2016-11-21 23:11:40臧衛(wèi)軍高穎慧向志雄張樂多
    上海醫(yī)藥 2016年21期
    關(guān)鍵詞:藥代動力學(xué)

    臧衛(wèi)軍+高穎慧+向志雄+張樂多

    摘 要 目的:對比上海新亞藥業(yè)與羅氏制藥生產(chǎn)的兩種注射用頭孢曲松鈉產(chǎn)品(簡稱為新亞和羅氏芬)在SD大鼠和食蟹猴的藥代動力學(xué)性質(zhì)差異。方法:實驗動物在靜脈注射和肌肉注射后,采用UPLC-MS/MS測定血漿中頭孢曲松濃度,通過Kinetica 5.1計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:靜脈注射后,新亞和羅氏芬在SD大鼠體內(nèi)的AUC0-t分別為483.4±179.5 μg·h/ml、542.4±166.0 μg·h/ml、在食蟹猴體內(nèi)分別為1 703.6±564.4 μg·h/ml、1 811.7±601.7 μg·h/ml。肌肉注射后,新亞和羅氏芬在SD大鼠體內(nèi)的AUC0-t分別為412.6±153.4 μg·h/ml、451.7±147.1 μg·h/ml、在食蟹猴體內(nèi)分別為1 454.9±592.9 μg·h/ml、1 367.3±772.0 μg·h/ml。相對于羅氏芬,新亞在SD大鼠體內(nèi)靜脈和肌肉注射的相對生物利用度分別為(89.1±98.6)%、(91.3±55.4)%、在食蟹猴體內(nèi)分別為(94.0±9.6)%、(106.4±103.0)%。結(jié)論:兩種制劑在大鼠和食蟹猴上的藥代動力學(xué)特點類似,未見顯著差異。

    關(guān)鍵詞 注射用頭孢曲松鈉 藥代動力學(xué) 相對生物利用度

    中圖分類號:R978.11; R969.1 文獻標識碼:A 文章編號:1006-1533(2016)21-0070-06

    Study on the pharmacokinetics of ceftriaxone sodium for injection and its relative bioavailability in SD rat and cynomolgus monkey

    ZANG Weijun*, GAO Yinghui, XIANG Zhixiong, ZHANG Leduo(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

    ABSTRACT Objective: To compare pharmacokinetic properties of two kinds of ceftriaxone sodium which were produced by Shanghai New Asia pharmaceutical and Roche pharmaceuticals (New Asia and Rocephin for short). Methods: SD rats and cynomolgus monkeys were intravenously or intramuscularly injected with one of the two preparations, respectively. Their concentrations in plasma were determined by UPLC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 5.1. Results: The areas under the curve (AUC0-t) of New Asia and Rocephin were 483.4±179.5 and 542.4±166.0 μg·h/ml in SD rats and 1 703.6±564.4 and 1 811.7±601.7μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intravenous injection and 412.6±153.4 and 451.7±147.1 μg·h/ml in SD rats and 1 454.9±592.9 and 1 367.3±772.0 μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intramuscular injection, respectively. The relative bioavailability of New Asia was(89.1±98.6)% and (94.0±9.6)% in SD rat and cynomolgus monkeys via intravenous injection and (91.3±55.4)% and (106.4±103.0)% in SD rat and cynomolgus monkeys via intramuscular injection, respectively. Conclusion: The pharmacokinetic properties of both preparations in SD rats and cynomolgus monkeys are similar and the significant differences are not found.

    KEY WORDS ceftriaxone sodium for injection; pharmacokinetic; relative bioavailability

    注射用頭孢曲松鈉屬于頭孢第三代廣譜抗生素,具有廣譜、高效、長效及不良反應(yīng)少等特點,臨床常用于控制格蘭陰性菌引起的感染[1]。目前國內(nèi)外有眾多企業(yè)生產(chǎn)該產(chǎn)品,上海新亞藥業(yè)為其中之一。本文研發(fā)了一種應(yīng)用UPLC-MS/MS檢測頭孢曲松鈉的方法,它具有高靈敏度、高選擇性的特點。運用此方法研究了上海新亞藥業(yè)產(chǎn)品(簡稱新亞)和原研企業(yè)羅氏制藥產(chǎn)品(羅氏芬)在大鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)特性,并進行等效性分析[2-3],以期為新亞產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 儀器

    API 4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理軟件(美國Applied Biosystem公司);Waters Acquity UPLC系統(tǒng),包括二元輸液泵,自動進樣器,(美國Waters公司);Valco 2-Position 型切換閥(美國Valco Instruments公司)。Thermo-X3R離心機(德國Thermo公司)、Eppendorf 熱封儀(美國Eppendorf公司)。

    1.2 藥品與試劑

    大鼠藥代動力學(xué)注射用頭孢曲松鈉藥品(上海新亞藥業(yè),批號1411128);原研藥羅氏芬(上海羅氏制藥有限公司,批號SH1793)。食蟹猴藥代動力學(xué)注射用頭孢曲松鈉藥品(上海新亞藥業(yè),批號1509138);原研藥羅氏芬(上海羅氏制藥有限公司,批號SH1800)。頭孢曲松鈉標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號130480-200903,含量83.7%)。內(nèi)標:替硝唑(上海醫(yī)藥合成研究室提供);甲醇(Merck KGaA,色譜純);肝素鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號20131017);醋酸銨(德國CNW,色譜純);去離子水(由Milli-Q純水儀制備)。

    1.3 實驗動物

    SD大鼠:24只,雌雄各半,180~200 g,生產(chǎn)許可證號:BK-SCXK(滬)2013-0016,動物合格證號:2008001655333。來源:上海西普爾必凱實驗動物有限公司。

    食蟹猴:12只,雄性,2~4 kg,生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2011-0002,動物合格證號:0002849。來源:廣西雄森靈長類實驗動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 溶液配制

    1)標準品儲備液 精密稱取24.75 mg頭孢曲松鈉標準品,置于1 ml離心管中,加水定容至414 μl,配制成濃度為50 mg/ml的標準品儲備液。

    2)標準曲線用溶液 取50 mg/ml標準品儲備液,用水依次稀釋儲備液配制成15 000、13 500、5 000、1 500、500、150、50、10、5 μg/ml的系列標準溶液1。取標準系列溶液1各10 μl,加入到190 μl空白血漿中,配制成750,675,250,75,25,7.5,2.5,0.5,0.25 μg/ml的標準曲線樣品[4-7]。

    3)質(zhì)控血漿樣品 精密稱取頭孢曲松鈉標準品21.94 mg,置于1 ml離心管中,加水定容至367 μl,配制成濃度為50 mg/ml的質(zhì)控標準品儲備液。先用水稀釋成12 000、2 250、5 μg/ml的3個溶液,然后各取10 μl加入到190μl空白血漿中,配制成600、112.5、0.25 μg/ml的高、中、低濃度質(zhì)控血漿樣品。

    1.4.2 給藥劑量和方法

    參照羅氏芬產(chǎn)品說明書,將新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉分別配制成:①SD大鼠靜脈注射用藥液10 mg/ml,給藥劑量為100 mg/kg、體積為10 ml/kg;②SD大鼠肌肉注射用藥液20 mg/ml,給藥劑量為100 mg/kg、體積為5 ml/kg;③食蟹猴靜脈注射用藥液25mg/ml,給藥劑量為50 mg/kg、體積為2 ml/kg;④食蟹猴肌肉注射用藥液50 mg/ml,給藥劑量為50 mg/kg、體積為1 ml/kg。

    1.4.3 實驗方案

    SD大鼠24只雌雄各半,分為4組,分別為羅氏芬和新亞靜脈注射組和肌肉注射組,每組3雌3雄。在給藥前,所有動物禁食過夜(10~18 h),給藥后4 h給食。分別于給藥前和給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h于大鼠眼底靜脈叢取血0.4 ml。

    健康雄性食蟹猴12只,采用交叉設(shè)計,分別靜脈或肌肉注射新亞產(chǎn)品及羅氏芬,間隔1周后給藥。受試動物在試驗日前3~7 d應(yīng)在試驗場所進行適應(yīng)性飼養(yǎng)。在給藥前,所有動物禁食過夜(10~18 h),給藥后4 h給食。給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h經(jīng)股靜脈采集血樣1.0 ml。

    血樣采集后加入5 mg/ml肝素鈉10 μl抗凝,放置冰上,于4 ℃、4 300×g離心5 min,取血漿至離心管中于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.4 血漿樣品處理

    取血漿樣品50 μl,加入200 μl含內(nèi)標(10 ng/ml替硝唑)的甲醇溶液沉淀蛋白。渦旋10 min,6 000×g離心10 min,取上清用起始流動相稀釋10倍后于96孔板中進樣分析。

    1.4.5 樣品測定方法

    色譜條件:BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm,美國Waters公司);流動相A為2 mmol/L醋酸銨水溶液,流動相B為甲醇溶液,梯度洗脫程序如下:0→0.5 min 流動相A和B 的比例為95∶5,0.5→1.0 min線性變至5∶95,1.0→2.2 min 維持5∶95,2.2→2.5 min 線性恢復(fù)至95∶5,2.5→3 min 保持95∶5。流速0.35 ml/min,進樣器溫度4 ℃,柱溫40 ℃,進樣量5 μl。

    質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源(Turbo Ionspray,ESI);源噴射電壓為5 500 V;溫度為500 ℃;離子源氣體1(N2)壓力為50 psi;離子源氣體2(N2)壓力為50 psi;氣簾氣體(N2)壓力為20 psi;碰撞氣壓力(CAD)為Medium;掃描時間為100 ms;正離子方式檢測;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),監(jiān)測離子對m/z 555.2→m/z 396.2(頭孢曲松鈉),m/z 248.1→m/z 121.0(替硝唑);頭孢曲松鈉和替硝唑的去簇電壓(DP)分別為60 V和85 V;碰撞能量(CE)分別為19 V和23 V[8-10]。

    2 結(jié)果

    2.1 方法學(xué)驗證

    2.1.1 方法的專屬性

    分別取6只大鼠和食蟹猴的空白血漿,除不加內(nèi)標外,按1.4.4項下方法處理并分析,得到空白樣品的色譜圖;將一定量的頭孢曲松鈉標準溶液和內(nèi)標溶液加入上述大鼠和食蟹猴空白血漿中,依同法操作,獲得相應(yīng)的色譜圖;同樣方法得到大鼠和食蟹猴給藥后4 h樣品色譜圖(圖1)。結(jié)果表明,大鼠和食蟹猴血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢曲松鈉及內(nèi)標的測定。

    2.1.2 線性關(guān)系

    以待測物濃度為橫坐標X (ng/ml),待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標Y,用加權(quán)(W =1/X2)最小二乘法進行回歸運算,求得大鼠標準曲線回歸方程為:Y=0.040 7X+0.0178(r =0.992 7);食蟹猴標準曲線回歸方程為:Y=0.028 9X+0.002 28(r=0.996 5)。根據(jù)標準曲線,本法頭孢曲松鈉的線性范圍均為0.25~750 μg/ml,定量下限為0.25 μg/ml。結(jié)果表明,2標準曲線回歸方程間斜率相差近一倍,原因可能是大鼠與食蟹猴種屬間存在一定基質(zhì)效應(yīng)。

    2.1.3 準確度與精密度

    取SD大鼠和食蟹猴質(zhì)控血漿樣品每個濃度各6份,并用隨行標準曲線計算測定的質(zhì)控樣品濃度,與配制濃度對照,求得本法的準確度和精密度(表1)。結(jié)果表明,它們的RSD均小于12%。

    2.2 SD大鼠PK試驗結(jié)果

    在SD大鼠體內(nèi)靜脈或肌肉注射羅氏芬和新亞產(chǎn)品的藥時曲線見圖2。采用Kinetica 5.1軟件非房室方法計算新亞和羅氏芬在大鼠給藥后的主要藥動學(xué)參數(shù):相對生物利用度F =受試藥AUC0-t/參比藥AUC0-t×100%。采用配對t檢驗,比較新亞和羅氏芬的頭孢曲松鈉藥動學(xué)參數(shù)在給藥后的差異,Tmax采用非參數(shù)檢驗,其他參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行檢驗。

    SD大鼠藥藥動學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞和t1/2在新亞和羅氏芬間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,表2)。

    2.3 食蟹猴PK試驗結(jié)果

    在食蟹猴體內(nèi)靜脈和肌肉注射羅氏芬或新亞產(chǎn)品的藥時曲線見圖2。根據(jù)Kinetica 5.1軟件非房室方法計算新亞和羅氏芬在食蟹猴給藥后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0~t、AUC0~∞和t1/2在新亞產(chǎn)品和羅氏芬間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,表3)。

    3 討論

    本研究建立了定量測定SD大鼠及食蟹猴血漿中頭孢曲松鈉的UPLC-MS/MS方法。分別在ESI源和APCI源下,對頭孢曲松鈉采用正、負離子兩種檢測模式進行研究,比較響應(yīng)信號強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),頭孢曲松鈉在兩種離子化源的負離子掃描方式下,不易裂解,加大裂解能量后,雖然可產(chǎn)生碎片離子,但豐度很低而且不穩(wěn)定,不適合做定量分析。而在正離子模式下,ESI源較APCI源可產(chǎn)生更高的靈敏度和更穩(wěn)定的碎片。因此本研究選擇ESI源,發(fā)現(xiàn)在正離子檢測模式下質(zhì)核比為396的離子峰豐度最高,而且穩(wěn)定,與相關(guān)文獻報道相符合[11]。

    為了提高分析靈敏度,改善峰形并縮短分析時間,分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動相中的有機相,結(jié)果表明添加甲醇可降低背景噪音,提高待測物的響應(yīng)度;嘗試了在水相中加入醋酸銨和甲酸溶液對峰形的影響,發(fā)現(xiàn)加入2 mmol/L醋酸銨可以改善峰形,而加入甲酸溶液后峰形變差;故選用2 mmol/L醋酸銨水溶液作為水相,甲醇溶液作為有機相。

    在大鼠實驗中,將大鼠隨機分為兩組,采用了配對t檢驗的方式進行計算,但大鼠之間存在一定的個體差異,因此生物利用度的標準偏差偏大。在食蟹猴實驗中,采用交叉實驗,有可能是前后兩次肌肉注射位置存在差異,導(dǎo)致肌肉群的吸收會存在一定的差異性,因此其最大濃度點的標準偏差偏大。

    本方法的專屬性好,靈敏度高,符合生物樣品的定量分析要求,分析時間僅為3 min,可為快速、準確地測定生物樣品中頭孢曲松鈉的血藥濃度提供有意義的參考。研究結(jié)果顯示,新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉靜脈和肌肉注射給藥后,在SD大鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)性質(zhì)接近,藥時曲線一致,主要藥代動力學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0~t、AUC0~∞和t1/2未見顯著性差異。相對于羅氏芬,新亞在SD大鼠體內(nèi)靜脈和肌肉注射的相對生物利用度分別為(89.1±98.6)%、(91.3±55.4)%、在食蟹猴體內(nèi)分別為(94.0±9.6)%、(106.4±103.0)%。兩制劑在SD大鼠和食蟹猴體內(nèi)生物等效。

    參考文獻

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