UPLC-MS/MS法測定頭孢哌酮鈉及其制劑中遺傳毒性雜質N-亞硝基二甲胺與N-亞硝基二乙胺

摘要：目的 建立UPLC-MS/MS法測定頭孢哌酮鈉及其制劑中遺傳毒性雜質N-亞硝基二甲胺（NDMA）與N-亞硝基二乙胺（NDEA）的含量。方法 采用GL Sciences InertsilTM ODS-3（100 mm×3.0 mm， 3 μm）色譜柱，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫為35 ℃；檢測方式為正離子（ESI+）模式下選擇離子監(jiān)測（SIM）。結果 NDMA在0.5416～270.8 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，檢測限（LOD）與定量限（LOQ）分別為0.008與0.01 ppb，加標回收率為99.3%～107.0%；NDEA在0.1463～73.14 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，檢測限（LOD）與定量限（LOQ）分別為0.001與0.002 ppb，加標回收率為90.0%～96.0%。對7批次原料、66批次制劑與影響因素試驗下放置的制劑進行測定，結果3批原料與30批制劑中檢出NDMA，所有樣品均未檢出NDEA；影響因素試驗下的制劑NDMA與NDEA均未增加。結論 該方法準確、專屬性強、靈敏度高，可用于頭孢哌酮鈉及其制劑中遺傳毒性雜質NDMA與NDEA的測定，并建議企業(yè)對頭孢哌酮鈉原料生產(chǎn)工藝進行評估并嚴格控制。

關鍵詞：頭孢哌酮鈉；注射用頭孢哌酮鈉；N-亞硝基二甲胺（NDMA）；N-亞硝基二乙胺（NDEA）；UPLC-MS/MS；遺傳毒性雜質

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Determination of genotoxic impurities N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylaminein in cefoperazone sodium and its preparations

by UPLC-MS/MS

Li Qian， Yang Bohan， Li Jie， Li Yitian， Wang Liping， and Liu Ying

（Henan Provincial Institute for Drug and Medical Device Control HenanVaccineIssuance Center， Henan Chemical Quality Evaluation

and Control Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective This study established an UPLC-MS/MS method for determination of genotoxic imputrity N-nitrosodimethylamine （NDMA） and N-nitrosodiethylamine （NDEA） in cefoperazone sodium and its preparations. Methods The analytes were separated on a GL Sciences InertsilTM ODS-3 （100 mm×3.0 mm， 3 μm） column. 0.1% formic acid was used as mobile phase A， methanol containing 0.1% formic acid was used as mobile phase B， and the gradient elution method was used. The flow was set at 0.3 mL/min， with a column temperature of 35 ℃. The target compound was analyzed in the positive ion SIM mode. Results The linear range of NDMA was in the range of 0.5416～270.8 ng/mL， the limit of detection （LOD） and the limit of quantitation （LOQ） were 0.008 and 0.01 ppb， and the recoveries were 99.3%-107.0%. The linear range of NDEA was in the range of 0.1463～73.14 ng/mL， the limit of detection （LOD） and the limit of quantitation （LOQ） were 0.001 ppb and 0.002 ppb and the recoveries were 90.0%-96.0%. The method was used to determine NDMA an NDEA in 7 batches of raw material， 66 batches of preparations， and influencing factors test samples. NDMA was detected in 3 batches of raw material and 30 batches of preparations. No NDEA was detected in all samples. NDMA and NDEA did not increase under the influence factor test. Conclusion This method was accurate， specific， and sensitive. It could be used for analysis of the NDMA and NDEA in cefoperazone sodium and its preparations. Enterprises should pay attention to the quality control of APIs.

Key words Cefoperazone sodium; Cefoperazone sodium for injection; N-nitrosodimethylamine （NDMA）; N-nitrosodiethylamine （NDEA）; UPLC-MS/MS; Genotoxic impurity

遺傳毒性雜質又稱基因毒性雜質，能與體內(nèi)遺傳物質發(fā)生反應，直接或間接地損傷細胞DNA，包括DNA烷基化、染色體斷裂、DNA重組及復制過程中共價鍵的插入和修飾等，導致基因突變，并有可能誘發(fā)腫瘤和癌癥[1-2]。

N-亞硝胺類雜質是具有強致突變性和致癌性的遺傳毒性雜質[3-4]，屬于ICH M7（R1）《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》指南中提及的“關注列隊”物質[5]，痕量水平即可誘發(fā)基因突變、染色體異常和DNA修復障礙，長期接觸可能會誘導體內(nèi)不同臟器腫瘤的產(chǎn)生[6-8]。國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）、歐洲藥物管理局（EMA）與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）均發(fā)布了人用藥中N-亞硝胺雜質控制的指導意見[9-11]，分析該類雜質產(chǎn)生的原因主要有3點：①由生產(chǎn)工藝引入，如使用了能引入仲胺和亞硝化試劑的物料、試劑、催化劑及中間體等；②由污染引入，如生產(chǎn)過程中使用了被亞硝胺類雜質污染的物料；③由降解產(chǎn)生，如藥物本身會降解亞硝胺類雜質。

頭孢哌酮鈉以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、1-甲基-5-巰基-四氮唑與氧哌嗪酸為起始物料，經(jīng)過一系列反應得到，合成過程中使用了N，N-二甲基乙酰胺、三乙胺等試劑[12]。文獻報道[13-14]1-甲基-5-巰基-四氮唑合成過程中通常會使用亞硝酸鈉用于淬滅殘留的疊氮化物，且疊氮試劑的合成通常涉及亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽與一甲胺或二甲胺反應可生成NDMA，與N，N-二甲基乙酰胺或三乙胺反應可生成NDEA，因此頭孢哌酮鈉的生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)生NDMA與NDEA雜質的風險。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的致癌物清單，NDMA與NDEA均為2A類致癌物，為保證該藥品的安全性，有必要對頭孢哌酮鈉原料及其制劑中NDMA與NDEA進行分析與控制。

注射用頭孢哌酮鈉為頭孢哌酮鈉原料藥無菌分裝，未添加任何輔料。參考《中國藥典》2020年版四部9306遺傳毒性雜質控制指導原則[15]，對于高致癌性雜質（如黃曲霉毒素、N-亞硝基化合物、烷基-氧化偶氮結構類化合物）應采用更嚴格的限值控制。雜質的限值為雜質可接受攝入量與藥物每日最大用量的比值。同時，F(xiàn)DA發(fā)布的《人用藥中亞硝胺雜質的控制指南》[11]與USP通則lt;1469gt;亞硝胺雜質中的規(guī)定[16]，NDMA雜質的每日可接受攝入量為96 ng，NDEA雜質的每日可接受攝入量為26.5 ng。根據(jù)注射用頭孢哌酮鈉每日最大服用劑量為9 g，計算頭孢哌酮鈉及其制劑注射用頭孢哌酮鈉中NDMA與NDEA的限度均分別為10.6與2.9 ppb。

由于該品種中NDMA與NDEA限度非常低，對測定方法的專屬性與靈敏度要求較高，采用常規(guī)的高效液相色譜法紫外檢測器難以實現(xiàn)，因此建立了靈敏度高專屬性好的超高效液相色譜離子肼高分辨質譜聯(lián)用分析頭孢哌酮鈉及其制劑中的NDMA與NDEA雜質方法，為該類藥物的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Thermo Scientific Q Exactive Plus超高效液相色譜-四級桿-離子肼高分辨質譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；XPE205電子天平（美國Mettler公司）；超純水由Millipore純水儀制備。

頭孢哌酮對照品（批號130420-201105，含量93.8%），N-亞硝基二甲胺（批號510166-202003，含量99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；N-亞硝基二乙胺（批號F0032407，含量99.7%）購自北京Mahage生物技術公司；質譜級甲酸（批號SHBL0331）購自Sigma公司；質譜級甲醇（批號11243235239）購自Merck公司。

2023年國家藥品抽檢樣品注射用頭孢哌酮鈉66批次，涉及5家生產(chǎn)企業(yè)（分別為4家國內(nèi)企業(yè)C、D、E、F與1家進口企業(yè)G）；調(diào)研收集7批次頭孢哌酮鈉原料，涉及3家生產(chǎn)企業(yè)（分別為A、B、C企業(yè)）。影響因素試驗樣品為取不同企業(yè)的注射用頭孢哌酮鈉各1批，分別在高溫（60 ℃）下放置30 d，在高濕（相對濕度92.5%）與強光照射（4500 Lx）下放置10 d。

2 方法

2.1 測定條件

色譜條件：采用GL Sciences InertsilTM ODS-3 （100 mm×3.0 mm， 3 μm）色譜柱，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，照表1進行洗脫。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI源），正離子模式檢測，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350 ℃，輔助氣溫度350 ℃，輔助氣流量10 mL/min，鞘氣流量40 mL/min，掃描模式為選擇離子監(jiān)測（SIM），質譜采集時間為3.0～6.0 min與13.0～16.0 min。目標離子精確質量數(shù)m/z[H]+：75.05538（NDMA）與103.08674（NDEA）。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含0.25 g的溶液。

2.2.2 對照品貯備液

分別取NDMA與NDEA對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含NDMA 2.7 mg與含NDEA 0.75 mg的混合溶液。

2.2.3 對照品溶液

精密量取對照品貯備液適量，加水制成每1 mL中約含NDMA 2.7 ng與NDEA 0.75 ng的混合溶液。

3 結果

3.1 專屬性考察

以水、甲醇作為空白溶劑，精密量取空白溶劑進樣，結果空白溶劑均不干擾頭孢哌酮鈉及其制劑中NDMA與NDEA的測定。

3.2 線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下的對照品貯備液，用水稀釋成含NDMA質量濃度分別為270.8、135.4、54.16、27.08、13.54、5.416、2.708、1.354與0.5416 ng/mL的溶液，作為NDMA線性溶液；含NDEA質量濃度分別為73.14、36.57、14.63、7.314、3.657、1.463、0.7314、0.3657與0.1463 ng/mL的溶液，作為NDEA線性溶液。分別進樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積A為縱坐標，NDMA或NDEA的進樣濃度C（ng/mL）為橫坐標，進行線性回歸，得NDMA與NDEA的回歸方程：

NDMA：A=1.0101×106C+1.5472×105，r=1.0000

NDEA：A=7.6054×105C-5.7645×104，r=1.0000

NDMA質量濃度在0.5416～270.8 ng/mL范圍內(nèi)，NDEA質量濃度在0.1463～73.14 ng/mL濃度范圍內(nèi)，與其峰面積線性關系均良好。

3.3 精密度試驗

取“2.2.3”項下的對照品溶液連續(xù)進樣6次，結果NDMA峰面積的RSD為1.6%，NDEA峰面積的RSD為1.7%，表明進樣精密度良好。

3.4 重復性試驗

按“2.2.1”項下方法制備注射用頭孢哌酮鈉供試品溶液共6份（批號220802101），以“2.2.3”項下的對照品溶液為外標計算。結果供試品中NDMA含量平均值為1.8 ppb，RSD為7.4%；6份樣品中均未檢出NDEA。

3. 5 定量限與檢測限

逐級稀釋“2.2.3”項下的對照品溶液，以信噪比S/N為10：1計，NDMA的定量限為0.01 ppb，NDEA的定量限為0.002 ppb。以信噪比S/N為3：1計，NDMA的檢測限為0.008 ppb，NDEA的檢測限為0.001 ppb。

3. 6 回收率試驗

取注射用頭孢哌酮鈉適量（共9份），精密稱定，分別加入適量的“3.2”項下NDMA與NDEA質量濃度分別為5.461與1.463 ng/mL的線性溶液，配制成高、中、低濃度的溶液，各濃度平行配制3份，以“2.2.3”項下的對照品溶液為外標計算，結果NDMA與NDEA的平均回收率分別為103.1%與92.9%，見表2。

3.7 穩(wěn)定性

取注射用頭孢哌酮鈉適量，精密稱定，加入“2.2.3”項下的對照品溶液溶解并稀釋成含NDMA與NDEA質量濃度分別為2.7與 0.75 ng/mL的溶液，即得加標供試品溶液。室溫放置，于第0～14 h內(nèi)進樣測定并記錄色譜圖，以NDMA與NDEA峰面積為指標，考察溶液的穩(wěn)定性。結果加標供試品溶液中NDMA與NDEA峰面積的RSD均為1.6%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3.8 樣品測定

3.8.1 " "原料與制劑

取7批次原料與66批次制劑，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以“2.2.3”項下的對照品溶液為外標計算各樣品中NDMA與NDEA的含量。結果見表3與圖1，7批次原料中有3批次檢出了NDMA，均來自C企業(yè)，結果為1.8～4.1 ppb，檢出率為42.9%；66批次制劑中有30批次檢出了NDMA，結果為1.2～4.4 ppb，檢出率為45.5%；其中檢出NDMA的制劑其原料均來源于C企業(yè)；檢出的NDMA含量均低于限度。所有樣品中均未檢出NDEA。

3.8.2 影響因素試驗

樣品取高溫、高濕及強光照射條件下的制劑，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以“2.2.3”項下的對照品溶液為外標計算各樣品中NDMA與NDEA的含量。結果各樣品中NDMA與NDEA含量與0 d比基本無變化。

3.9 耐用性

由于供試品濃度較大為0.25 g/mL，其雜質峰也較大，色譜條件的變化如流動相比例、柱溫（±5 ℃）的改變，可導致雜質峰干擾NDMA或NDEA的檢測。雖然該方法可以通過SIM模式提取出目標離子峰進行測定，但雜質峰可進入質譜儀中易污染儀器，因此僅對質譜參數(shù)進行耐用性考察。改變噴霧電壓、離子傳輸管溫度與輔助氣溫度，對照品溶液中NDMA與NDEA峰面積響應基本無變化。

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗的難點在于梯度洗脫程序的優(yōu)化。由于供試品溶液的濃度較大，頭孢哌酮主峰與其雜質峰也較大，易干擾樣品中NDMA與NDEA的檢測。優(yōu)化流動相A與流動相B的比例，使頭孢哌酮主峰的保留時間在NDMA與NDEA之后，不進入質譜避免污染儀器，并使頭孢哌酮的雜質峰不干擾NDMA與NDEA的檢測。供試品濃度方面，當供試品濃度增加為0.5 g/mL時，供試品中的雜質峰增大且峰展寬，干擾樣品中NDMA的測定；降低供試品濃度，則降低了NDMA與NDEA的檢測濃度。綜合考慮，選擇供試品的濃度為0.25 g/mL。

4.2 樣品的質量評價

通過對3家企業(yè)的7批次頭孢哌酮鈉原料與5家企業(yè)的66批次注射用頭孢哌酮鈉進行NDMA與NDEA的含量測定，發(fā)現(xiàn)有3批次原料與30批次制劑中檢出NDMA，所有檢出NDMA樣品的原料均來源于原料企業(yè)C。注射用頭孢哌酮鈉為頭孢哌酮鈉原料無菌分裝得到，未添加任何輔料。結合影響因素試驗，樣品在高溫、高濕與強光照射條件下放置后NDMA與NDEA的含量均未增加，表明該樣品在影響因素條件下不降解產(chǎn)生NDMA與NDEA。因此分析頭孢哌酮鈉及其制劑在貯藏過程中不產(chǎn)生NDMA，NDMA來源于頭孢哌酮鈉原料的生產(chǎn)過程。

4.3 NDMA與NDEA的來源分析

通過考察頭孢哌酮鈉原料、制劑與影響因素試驗樣品，發(fā)現(xiàn)NDMA來源于頭孢哌酮鈉原料的生產(chǎn)過程。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，3家原料的生產(chǎn)工藝基本一致，均以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、1-甲基-5-巰基-四氮唑及氧哌嗪酸為起始物料，經(jīng)過一系列反應得到頭孢哌酮，再通過碳酸氫鈉成鹽得到頭孢哌酮鈉。其中起始物料1-甲基-5-巰基-四氮唑合成過程中使用了異硫氰酸甲酯與疊氮化鈉，異硫氰酸甲酯中殘留的工藝雜質一甲胺與疊氮化鈉中殘留的亞硝酸鹽反應，可產(chǎn)生NDMA。由起始物料中引入的NDMA在后續(xù)合成過程中如不被清除，可傳遞到頭孢哌酮鈉原料成品中，進而傳遞到制劑中。此外，疊氮化鈉中殘留的亞硝酸鈉與頭孢哌酮鈉生產(chǎn)工藝中使用的試劑N，N-二甲基乙酰胺或三乙胺反應，還可產(chǎn)生NDEA。

因此，原料企業(yè)C需對頭孢哌酮鈉的起始物料進行嚴格篩選與控制，并在后續(xù)合成工藝中增加清除NDMA的工藝，以保證產(chǎn)品的安全性。同時需嚴格控制起始物料中亞硝酸鹽的含量，防止其在頭孢哌酮鈉的后續(xù)合成過程中產(chǎn)生NDEA雜質，確保樣品的安全性。

參 考 文 獻

Snodin D J. Genotoxic impurity： from structural alerts to qualification[J]. Org Process Res Dev， 2010， 14（4）： 960-976.

孫白浩， 李文龍， 關皓月， 等. 仿制藥中遺傳毒性雜質的研究進展[J]. 臨床藥物治療雜志， 2022， 20（2）： 8-12.

楊竹， 杭太俊， 郭曉迪， 等. N-亞硝胺類基因毒性雜質的研究進展[J]. 藥學與臨床研究， 2020， 28（4）： 270-274.

葛雨琦， 葉曉霞， 樂健， 等. N-亞硝胺類基因毒性雜質毒性與檢測方法研究進展[J]. 藥物分析雜志， 2020， 40（1）： 83-89.

International Council for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use. M7 （R1）： Assessment and control of DNA reactive（mutagenic） impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic[S]. 2017： 10-12.

葉倩， 耿興超， 張河戰(zhàn)， 等. 亞硝胺類遺傳毒性雜質的監(jiān)管策略及思考[J]. 中國藥事， 2021， 35（2）： 127-137.

Roux J L， Gallard H， Croue J， et al. NDMA formation by chloramination of ranitidine： Kinetics and mechanism[J]. Environ Sci Technol， 2012， 46（20）： 11095-11103.

Senthong P， Boriboon U. Evaluation of occupational exposure to nitrosamine， carbon black and dust in rubber processing industry[J]. Int J Occup Environ Med， 2017， 8（3）： 181-183.

國家藥品監(jiān)督管理局. 化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則（試行）[EB/OL]. [2020-05-08]. https：//nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ypggtg/ypqtggtg/20200508160101122.html.

European Medicines Agency. Assessment report[EB/OL].[2020-07-09]. http：//www.ema.europa.eu/en/documents/referral/nitrosamines-emea-h-a53-1490-assessment-report-en.pdf.

US. Food and Drug Administration. Control of nitrosamine impurities in human drugs[EB/OL]. [2020-09-01]. https：//www.fda.gov/media/141720/download.

金石， 黃金花， 徐澤龍， 等. 第三代頭孢菌素頭孢哌酮鈉的合成工藝研究[J]. 中國藥物化學雜志， 2004， 14（3）： 3158-3160.

張霽， 張英俊， 聶飚. 藥物研發(fā)中基因毒性雜質的控制策略與方法探索進展[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2018， 49（9）： 1203-1220.

朱文泉， 馬健， 李敏. 基因毒性雜質的挑戰(zhàn)與控制策略-從ICH指導綱領到實際操作層面[J]. 中國食品藥品監(jiān)管， 2020， 12： 29-44.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版四部）. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 527-530.

USP-NF Online： lt;1469gt; NITROSAMINE IMPURISIES[EB/OL]. [2022-5-27]. http：//online.uspnf.com/uspnf/document/1_GUID-C97F817C-A388-4693-8E0C-2F0A0A371977_2_en-US.