疏肝解郁安神方干預(yù)冠心病合并抑郁狀態(tài)的代謝組學(xué)研究

摘要 目的：探究疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的作用機(jī)制。方法：納入2021年10月—2022年1月于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的冠心病合并抑郁狀態(tài)病人，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組9例（疏肝解郁安神方＋西醫(yī)常規(guī)治療＋心理疏導(dǎo)治療），對(duì)照組8例（西醫(yī)常規(guī)治療＋心理疏導(dǎo)治療），療程為1周。利用高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC－MS）檢測(cè)兩組病人治療前后的血清代謝物，篩選潛在的差異代謝物，預(yù)測(cè)與疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)相關(guān)的代謝通路。結(jié)果：冠心病合并抑郁狀態(tài)病人具有相似的代謝譜特征；通過二級(jí)質(zhì)譜分析，最終共得到26個(gè)二級(jí)差異代謝物。與干預(yù)前冠心病合并抑郁狀態(tài)病人代謝譜相比，疏肝解郁安神方干預(yù)后，黃芩苷、漆黃素、N5－L－1－羧乙基－L－鳥氨酸、5－羥色胺、烏頭酸鹽、半胱氨酸硫酸酯、5－2－羥乙基－4－甲基噻唑7個(gè)代謝物在中藥干預(yù)后表達(dá)水平上調(diào)；N－［（3a，5b，7a）－3－羥基－24－氧代－7－（亞砜基）膽聚糖－24－基］－甘氨酸、L－赤霉素、十一烷酸、瓜氨酸、壬酸、氧化苯乙烯6個(gè)代謝物在中藥干預(yù)后表達(dá)水平下調(diào)；同時(shí)對(duì)獲得的26個(gè)二級(jí)差異代謝物進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，最終富集到46條代謝通路，富集度最為顯著的4條通路分別為環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路、檸檬酸循環(huán)、膽汁分泌、5－羥色胺能突觸通路。結(jié)論：本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)揭示了疾病和中藥復(fù)方干預(yù)后機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)物變化，從代謝終端產(chǎn)物層面闡述了疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的作用機(jī)制，為后續(xù)試驗(yàn)的開展和新藥的研發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 冠心病；抑郁狀態(tài)；疏肝解郁安神方；代謝組學(xué)

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.12.001

Metabolomics Study on the Intervention of Shugan Jieyu Anshen Formula for Coronary Heart Disease Complicated with Depression

CHEN Ruihua， DU Mingyuan， GUO Yuqing， LIU Gang， LI Yizhuo， ZHU Cuiling， LI Xingyuan， YAN Haifeng， YAN Kuipo

Department of Emergency， the First Affiliated Hospital" of Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450002， Henan， China

Corresponding Author YAN Kuipo， E－mail： ykp19821122@163.com

Abstract Objective：To explore the mechanism of Shugan Jieyu Anshen Formula for treating coronary heart disease with depression.Methods：Patients with coronary heart disease and depression were randomly divided into treatment group（9 cases，Shugan Jieyu Anshen Formula＋Western medicine conventional treatment＋psychological counseling treatment） and control group（8 cases，Western medicine conventional treatment＋psychological counseling treatment），treated for 1 week.The high－performance liquid chromatography－mass spectrometry（HPLC－MS） was used to detect serum metabolites before and after treatment in two groups，screen for potential differential metabolites，and predict metabolic pathways related to the treatment of coronary heart disease combined with depression with Shugan Jieyu Anshen Formula.Results：Through secondary mass spectrometry analysis，a total of 26 secondary differential metabolites were ultimately obtained in this study.After the intervention of Shugan Jieyu Anshen Formula，compared with the metabolic spectrum of patients with coronary heart disease complicated with depression before intervention，the expression levels of seven metabolites（baicalin，fisetin，N5－L－1－carboxyethyl－L－ornidine，5－h(huán)ydroxytryptamine，aconite，cysteine sulfate，5－2－h(huán)ydroxyethyl－4－methylthiazole） were up－regulated after the intervention of traditional Chinese medicine.The expression levels of six metabolites，including N－［（3a， 5b，7a）－3－h(huán)ydroxy－24－oxy－7－（sulfoxide） choleglycan－24－yl］－glycine，L－gibberellin，undecanoic acid，citrulline，nonanoic acid，and styrene oxide were downregulated after traditional Chinese medicine intervention.The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis showed there were 26 secondary differential metabolites，and ultimate enrichment showed there were 46 metabolic pathways.The four pathways that were significantly enriched include the cAMP signaling pathway，citric acid cycle（TCA cycle），bile secretion，and 5－h(huán)ydroxytryptamine synaptic pathway.Conclusion：This study reveal what exactly happened in the body after diseases and" the intervention by traditional Chinese medicine prescriptions.From the perspective of metabolic end products，it elucidated the mechanism of action of Shugan Jieyu Anshen Formula for treating coronary heart disease with depression，providing a certain reference basis for subsequent experiments and the development of new drugs.

Keywords coronary heart disease; depressive state; Shugan Jieyu Anshen Formula; metabolomics

冠心病是臨床常見的心血管疾病，其發(fā)病率居高不下并向年輕化進(jìn)展，且常與抑郁共同發(fā)病［1］。

流行病學(xué)研究指出，每5個(gè)冠心病病人中就有1個(gè)合并抑郁癥，其在冠心病中的發(fā)病率約為一般人群中的3倍［2－4］。抑郁是冠心病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以顯著升高冠心病發(fā)病率、心血管事件發(fā)生率及病死率，加速病程進(jìn)展，嚴(yán)重影響病人預(yù)后［5－6］。冠心病合并抑郁狀態(tài)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與之對(duì)應(yīng)的中醫(yī)證型繁多而復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一的治療方案。閆奎坡教授基于“從肝之心”理論與前期臨床經(jīng)驗(yàn)，將小柴胡湯和酸棗仁湯合方為疏肝解郁安神方，用于冠心病合并抑郁狀態(tài)的治療，并取得確切療效。但既往的研究主要從整體療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，缺乏相關(guān)的機(jī)制研究。代謝組學(xué)技術(shù)為系統(tǒng)闡釋中藥復(fù)方治療疾病發(fā)病機(jī)制提供了有力的研究手段。代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，其致力于研究細(xì)胞、組織、生物體受到外部刺激（包括疾病和藥物），體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝物種類及其數(shù)量變化規(guī)律［7－10］。通過代謝組學(xué)技術(shù)，可以建立內(nèi)源性代謝產(chǎn)物與刺激導(dǎo)致病理生理變化的聯(lián)系，在疾病的診斷與治療中提供了重要思路。本研究通過高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC－MS）技術(shù)對(duì)疏肝解郁安神方干預(yù)前后冠心病合并抑郁狀態(tài)病人血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，觀察內(nèi)源性代謝物的代謝組學(xué)特征譜，篩選差異代謝物，尋找疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的生物標(biāo)志物及信號(hào)通路，進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇與分組

選取2021年10月—2022年1月于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的冠心病合并抑郁狀態(tài)病人17例為研究對(duì)象。按照就診順序編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組（9例）與對(duì)照組（8例）。病人均符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)2018年頒布的《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》［11］、中國醫(yī)師協(xié)會(huì)急診醫(yī)師分會(huì)2019年發(fā)布的《急性冠脈綜合征急診快速診治指南（2019）》［12］制定的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。 抑郁狀態(tài)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《精神與行為障礙分類》第10版（ICD－10）的相關(guān)診斷；符合漢密爾頓抑郁量表（HAMD）24項(xiàng)評(píng)分。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照2002年頒布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》和中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病專業(yè)委員會(huì)雙心學(xué)組2017年發(fā)布的《雙心疾病中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識(shí)》［13］標(biāo)準(zhǔn)，胸痹合并郁證屬肝郁氣滯、氣滯血瘀證型。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1）年齡18～75歲，不限性別；2）符合上述西醫(yī)診斷及中醫(yī)診斷，證屬肝郁氣滯、氣滯血瘀證；3）符合ICD－10抑郁癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；4）HAMD 24項(xiàng)評(píng)分為8～35分；5）病人自愿簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

1）重度抑郁難以配合者；2）HAMD 24項(xiàng)評(píng)分＜8分或＞35分；3）主診斷為主動(dòng)脈夾層、風(fēng)濕性心臟病、嚴(yán)重的心律失常等非冠心病，或冠心病不符合抑郁診斷標(biāo)準(zhǔn)的病人；4）雙相情感障礙、難治性抑郁（應(yīng)用2種或以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗抑郁藥，經(jīng)足量、足療程治療無效或收效甚微）；5）合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，以及嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；6）入組前1個(gè)月內(nèi)服用過抗抑郁、抗焦慮西藥者；7）妊娠、哺乳期婦女或尿妊娠試驗(yàn)陽性者；8）藥物或乙醇成癮者；9）過敏體質(zhì)。

1.5 脫落病例、剔除病例標(biāo)準(zhǔn)及處理

1.5.1 剔除病例標(biāo)準(zhǔn)及處理

1）誤診或不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病人；2）受試者入組后未曾服藥者；3）聯(lián)合應(yīng)用其他對(duì)研究結(jié)果影響較大的藥物，影響臨床指標(biāo)的評(píng)價(jià)；4）在研究期間還參加了其他研究者；5）入組后沒有任何數(shù)據(jù)，無法進(jìn)行分析；符合以上任意1項(xiàng)即由研究者終止試驗(yàn)并剔除。

1.5.2 脫落病例標(biāo)準(zhǔn)及處理

對(duì)已經(jīng)符合入組標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書的受試者，在研究過程中由于各種原因不能按照既有研究方案順利完成試驗(yàn)內(nèi)容的病例定義為脫落病例。包括以下幾類：1）病人在治療過程中自覺療效太差或不良反應(yīng)難以忍受等情況；2）由于病人依從性太差，不能按照研究方案進(jìn)行治療及相關(guān)檢查；3）治療過程中病人出現(xiàn)嚴(yán)重的合并癥、并發(fā)癥、嚴(yán)重不良事件等；4）雖然完成了試驗(yàn)，但服藥量不滿足應(yīng)服藥量的80%～120%。

針對(duì)脫落病例，研究者應(yīng)詳細(xì)記錄脫落原因，同時(shí)保留臨床病例報(bào)告表（CRF表）以備查驗(yàn)。

1.6 干預(yù)措施

對(duì)照組給予西醫(yī)常規(guī)治療［β受體阻滯劑、硝酸酯類、鈣離子通道抑制劑（CCB）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類藥物、抗血小板類藥物、他汀類藥物等］及心理疏導(dǎo)治療，合并其他疾病則按照相關(guān)診療指南進(jìn)行規(guī)范化治療。治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予疏肝解郁安神方，每日2次，每次200 mL，分早、晚溫服。兩組療程均為1周。疏肝解郁安神方組方：柴胡15 g，黃芩9 g，半夏9 g，生姜9 g，人參6 g，炙甘草15 g，大棗4 枚，酸棗仁30 g，茯苓30 g，川芎15 g，知母15 g。由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥房提供。心理疏導(dǎo)治療：針對(duì)病人自身心理問題，采取疏導(dǎo)、安慰等方式減輕其負(fù)面情緒。對(duì)照組、治療組均不給予包含針灸、推拿、穴位注射等在內(nèi)的其他中醫(yī)治療手段，并詳細(xì)記錄各病人治療期間用藥情況，以備后續(xù)分析。

1.7 倫理

本研究在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下開展，納入病人均自愿簽署知情同意書，受試者信息不公開。

1.8 血清標(biāo)本的采集

兩組病人分別在治療前后（入院第2天、第9天）于晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血4 mL，置于真空采血管。將收集到的標(biāo)本放置于室溫條件下靜置30 min，待凝血分層后進(jìn)行離心，設(shè)置離心機(jī)溫度為4℃，轉(zhuǎn)速

3 000 r/min，離心時(shí)間10 min，取離心后的上層血清200 μL，分裝至冷藏管內(nèi)，進(jìn)行編號(hào)并置于－80 ℃冰箱保存以待后續(xù)代謝組學(xué)檢測(cè)。將治療組治療前、后血清分別記為A1、A2；對(duì)照組治療前、后血清分別記為B1、B2；將兩組受試者治療前血清樣本共同記為C組（A1＋B1）。

1.9 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Thermo Vanquish超高效液相系統(tǒng)，使用ACQUITY UPLCHSST3（2.1×150 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA，USA）色譜柱，設(shè)置流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。正離子模式下，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸銨水，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，2%甲酸乙腈；1～9 min，2%～50%甲酸乙腈；9～12 min，50%～98%甲酸乙腈；12.0～13.5 min，98%甲酸乙腈；13.5～14.0 min，98%～2%甲酸乙腈；14～20 min，2%甲酸乙腈。負(fù)離子模式下，流動(dòng)相為乙腈和5mmol/L甲酸銨水，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，2%乙腈；1～9 min，2%～50%乙腈；9～12 min，50%～98%乙腈；12.0～13.5 min，98%乙腈；13.5～14.0 min，98%～2%乙腈；14～17 min，2%乙腈［14－15］。質(zhì)譜條件：使用Thermo Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為－2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度為325 ℃，以分辨率60000進(jìn)行一級(jí)全掃描，一級(jí)離子掃描范圍

m/z100～1000，并采用高能碰撞解離（high energy collision dissociation，HCD）進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30%，以分辨率15 000進(jìn)行二級(jí)掃描，采集信號(hào)前4離子進(jìn)行碎裂，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息［16］。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

1.10.1 數(shù)據(jù)處理

通過Proteowizard軟件包（v3.0.8789）［17］中MSConvert工具將原始質(zhì)譜下機(jī)文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式。采用R XCMS軟件包［18］進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過濾、峰對(duì)齊處理，得到物質(zhì)定量列表，參數(shù)設(shè)置為：

bw＝2，ppm＝15，peakwidth＝c（5，30），mzwid＝0.015，mzdiff＝0.01，method＝“centWave”。采用HMDB（http：//www.hmdb.ca）、massbank（http：//www.massbank.jp/）、LipidMaps（http：//www.lipidmaps.org）、mzclound（https：//www.mzcloud.org）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）等公共數(shù)據(jù)庫［19－23］及自建物質(zhì)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定，參數(shù)設(shè)置為ppm＜30。通過基于質(zhì)量控制（QC）樣本的局部加權(quán)回歸（LOESS）［24］信號(hào)校正方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)矯正，消除系統(tǒng)誤差。在數(shù)據(jù)質(zhì)控中過濾掉QC樣本中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＞30%的物質(zhì)。

1.10.2 數(shù)據(jù)分析

采用R軟件中Ropls包［25］對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA）降維分析，并繪制得分圖，展示各樣本間代謝物組成的差異。根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算P值、OPLS－DA降維方法計(jì)算變量投影重要度（VIP）、fold change計(jì)算組間差異倍數(shù)，衡量各代謝物組分含量對(duì)樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，篩選差異代謝物，當(dāng)P＜0.05和VIP＞1時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.10.3 差異代謝物京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

采用MetaboAnalyst軟件包［26］對(duì)篩選得到的差異代謝分子進(jìn)行KEGG通路富集分析和拓?fù)鋵W(xué)分析，將富集得到的通路采用KEGG Mapper工具進(jìn)行可視化，得到差異代謝物的通路圖，預(yù)測(cè)代謝機(jī)制。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件對(duì)觀察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若定量資料符合正態(tài)分布，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，若方差齊，則組間比較選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；方差不齊，則選擇獨(dú)立樣本異方差t檢驗(yàn)；若定量資料不符合正態(tài)分布，則選擇秩和檢驗(yàn)；定性資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜

0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

本研究共納入冠心病合并抑郁狀態(tài)病人17例，其中，對(duì)照組1例入組后依從性差，未能按照研究方案完成相關(guān)檢驗(yàn)，視為脫落病例；最終治療組9例、對(duì)照組7例病人完成研究，兩組病人臨床癥狀均得到有效改善。將治療組干預(yù)前血清標(biāo)本記為A1，干預(yù)后記為A2；對(duì)照組干預(yù)前血清標(biāo)本記為B1，干預(yù)后記為B2；將兩組病人干預(yù)前血清標(biāo)本共同記為C組（A1＋B1）。兩組治療前后共收集血清標(biāo)本32個(gè)，以待后續(xù)代謝組學(xué)檢測(cè)。

2.2 兩組基線資料可比性

兩組治療前年齡、性別、疾病類型、既往病史（高血壓、糖尿病、高脂血癥、腦血管疾病）、吸煙史、血脂、既往心肌梗死病史、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）/冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（GABA）病史等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示兩組基線資料具有可比性。詳見表1。

2.3 兩組治療前HAMD 24項(xiàng)評(píng)分可比性

治療前兩組HAMD 24項(xiàng)評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示兩組病人治療前HAMD評(píng)分具有可比性。詳見表2。

2.4 安全性指標(biāo)

兩組病人治療前后血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、肝功能、腎功能、電解質(zhì)等指標(biāo)未見明顯異常，提示疏肝解郁安神方安全性較好。兩組病人治療期間均未見明顯不良反應(yīng)。

2.5 代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 基峰色譜圖

正、負(fù)離子模式下不同組別典型樣本基峰色譜圖見圖1、圖2。正、負(fù)離子模式下，不同組別樣本出峰情況良好，色譜圖趨勢(shì)相似，提示各組別數(shù)據(jù)重復(fù)性高，分析結(jié)果可靠。2.5.2 質(zhì)量控制與保證

主成分分析法（PCA）得分圖中綠色代表實(shí)驗(yàn)樣本，紅色代表QC樣本。正負(fù)離子模式下QC樣本聚集分布，RSD＜30%的特征峰比例分別達(dá)到72.6%和75.7%，說明QC樣本重復(fù)性較好，系統(tǒng)、儀器較為穩(wěn)定。同時(shí)實(shí)驗(yàn)樣本趨勢(shì)離散分開，說明樣本數(shù)據(jù)可靠。詳見圖3、圖4。

2.5.3 OPLS－DA

通過Ropls包進(jìn)行OPLS－DA并繪制PCA得分圖，結(jié)果見圖5。正、負(fù)離子模式下，A2，B2，C（A1＋B1）組間樣本分布點(diǎn)均分離明顯，離散度較好，進(jìn)一步說明各組間樣本代謝物成分差異明顯；組內(nèi)各樣本分布相對(duì)聚集，說明組內(nèi)各樣本代謝物成分越相似，數(shù)據(jù)重復(fù)性好。

2.5.4 差異代謝物箱式圖

采用箱式圖對(duì)26個(gè)差異代謝物的組間分布特征進(jìn)行可視化，直觀地了解每個(gè)差異代謝物的組間分布情況。箱式圖通過最大值、最小值、其兩者的差值的間距和平均值反映組間數(shù)據(jù)分布特征和變異程度。其中，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示同一代謝物在不同組間的表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A2、B2、C組（A1＋B1）間顯著差異代謝物箱式圖見圖6、圖7。A2組與C組相比，7個(gè)代謝物的物質(zhì)表達(dá)水平相較于治療前上調(diào)，分別是：baicalin（黃芩苷），fisetin（漆黃素），N5－（L－1－carboxyethyl）－L－ornithine（N5－L－1－羧乙基－L－鳥氨酸），serotonin［5－羥色胺（5－H）］，cis－aconitate（烏頭酸鹽），cysteine－S－sulfate（半胱氨酸硫酸酯），5－（2－h(huán)ydroxyethyl）－4－methylthiazole（5－2－羥乙基－4－甲基噻唑）；有6個(gè)代謝物的物質(zhì)表達(dá)水平相較于治療前下調(diào)，分別是N－［（3a，5b，7a）－3－h(huán)ydroxy－24－oxo－7－（sulfooxy）cholan－24－yl］－glycine（N－［（3a，5b，7a）－3－羥基－24－氧代－7－（亞砜基）膽聚糖－24－基］－甘氨酸），L－erythrulose（L－赤霉素），undecanoic acid（十一烷酸），citrulline（瓜氨酸），pelargonic acid（壬酸），styrene oxide（氧化苯乙烯）。A2組與B2組相比較，兩組間baicalin（黃芩苷）的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5.5 二級(jí)差異代謝物KEGG通路富集分析

利用Metaboanalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）中的MetPA數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的二級(jí)差異代謝物進(jìn)行KEGG富集分析，26個(gè)差異代謝物最終共富集到46條通路。以P＜0.05為依據(jù)對(duì)富集通路進(jìn)行篩選，最終篩選出4條富集程度最為顯著的代謝通路，分別為cAMP signaling pathway［環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路）］、citrate cycle（TCA cycle）［檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）］、bile secretion（膽汁分泌）、serotonergic synapse（5－HT能突觸）通路，表明該4條通路受二級(jí)差異代謝物的影響較大，推測(cè)疏肝解郁安神方主要通過上述代謝通路發(fā)揮治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的效用。詳見表3。

3 討 論

冠心病合并抑郁狀態(tài)的演變過程中常數(shù)證相間，僅僅應(yīng)用單一方藥難以完全做到藥證相對(duì)，易致臨床效果不佳。因此，中藥的隨證加減就顯得尤為重要。中藥復(fù)方是“藥物配伍”理念的進(jìn)一步延伸［27］，臨床通過對(duì)不同方劑進(jìn)行組方，發(fā)揮協(xié)同作用，更加全面地對(duì)疾病進(jìn)行治療。疏肝解郁安神方是由經(jīng)方小柴胡湯及酸棗仁湯合方而成的中藥復(fù)方，是在小柴胡湯疏調(diào)肝氣、調(diào)暢情志的基礎(chǔ)上，合酸棗仁湯補(bǔ)養(yǎng)心肝、寧心安神，全方疏肝解郁、寧心安神，發(fā)揮對(duì)雙心疾病的治療效用。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與既往眾多的小柴胡湯與酸棗仁湯藥理學(xué)研究，為疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的作用機(jī)制提供了一定參考依據(jù)，但由于兩方相合之后方劑之間形成了新的配伍，其效用絕非兩者的簡(jiǎn)單疊加，因此，本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)兩組冠心病合并抑郁狀態(tài)病人干預(yù)前后血清進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，尋找與疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)有關(guān)的差異代謝物，并進(jìn)行KEGG通路富集，預(yù)測(cè)其發(fā)揮治療作用的相關(guān)代謝通路，進(jìn)一步闡釋疏肝解郁安神方干預(yù)冠心病合并抑郁狀態(tài)的機(jī)制，為冠心病合并抑郁狀態(tài)的治療尋找切入點(diǎn)［28－29］。

通過多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制PCA得分圖，研究發(fā)現(xiàn)，各組間樣本點(diǎn)分離趨勢(shì)明顯，離散度好，各組內(nèi)樣本點(diǎn)分布聚集，離散度差，表明各組均具有獨(dú)特的代謝譜，且各組間代謝譜有顯著差異，提示冠心病合并抑郁狀態(tài)病人具有自身獨(dú)特的代謝譜；與冠心病合并抑郁狀態(tài)病人代謝譜相比，干預(yù)后兩組代謝譜具有顯著差異，且兩組間代謝譜存在顯著差異，說明治療組與對(duì)照組發(fā)揮療效的機(jī)制不同。

通過二級(jí)質(zhì)譜分析，與各數(shù)據(jù)庫信息匹配注釋后，本研究最終共得到26個(gè)差異代謝物。箱式圖結(jié)果表明，26個(gè)差異代謝物中，黃芩苷、漆黃素、N5－L－1－羧乙基－L－鳥氨酸、5－HT、烏頭酸鹽、半胱氨酸硫酸酯、5－2－羥乙基－4－甲基噻唑7個(gè)代謝物在中藥治療后表達(dá)水平上調(diào)，表達(dá)量具有顯著差異；N－［（3a，5b，7a）－3－羥基－24－氧代－7－（亞砜基）膽聚糖－24－基］－甘氨酸、L－赤霉素、十一烷酸、瓜氨酸、壬酸、氧化苯乙烯6個(gè)代謝物在中藥治療后表達(dá)水平下調(diào)，表達(dá)量具有顯著差異。說明上述代謝物可能是疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究對(duì)獲得的26個(gè)二級(jí)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，最終富集到46條代謝通路，以P＜0.05篩選得到富集度最為顯著的4條通路，分別為cAMP信號(hào)通路、檸檬酸循環(huán)、膽汁分泌、5－HT能突觸通路。說明疏肝解郁安神方通過干預(yù)上述4條代謝通路發(fā)揮治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的作用。通過與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通路進(jìn)行結(jié)合分析，認(rèn)為cAMP信號(hào)通路及5－羥色胺能突觸通路是疏肝解郁安神方治療冠心病合并抑郁狀態(tài)作用機(jī)制的關(guān)鍵代謝途徑，其可能的作用機(jī)制：1）cAMP信號(hào)通路。cAMP是人體的第二大信使，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝和參與生物功能的重要物質(zhì)，在心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)均具有重要作用。既往眾多研究已經(jīng)證實(shí)，cAMP能夠通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和抗缺血能力，抑制心肌細(xì)胞的損傷，保護(hù)心臟［30］；還能夠促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流，增強(qiáng)興奮－收縮偶聯(lián)，強(qiáng)化心肌收縮力，改善心排血量；此外，還可以通過抑制血小板聚集，防止冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成；抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎性因子對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，延緩冠狀動(dòng)脈硬化進(jìn)程。因此，cAMP信號(hào)通路主要通過參與抗氧化、抗缺血、抑制心肌細(xì)胞損傷、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流等生物學(xué)過程，共同發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Curran等［31－32］研究表明，機(jī)體內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶能夠通過腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質(zhì)與β－腎上腺素能受體結(jié)合被激活，從而促進(jìn)cAMP表達(dá)量的增加，激活下游通路，促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流，增強(qiáng)興奮－收縮偶聯(lián)，提高心肌收縮力，并改善心排血量。同時(shí)cAMP促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流還可以產(chǎn)生正性肌力作用與擴(kuò)張外周血管作用，減少心臟前后負(fù)荷［33］。胡俊媛［33］研究表明，cAMP能夠下調(diào)血漿中cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基（PRKACA）水平，有效減少心肌耗氧量，進(jìn)而減輕心臟負(fù)荷，抑制心肌重構(gòu)，改善冠心病病人的臨床療效與預(yù)后。除了上述心臟保護(hù)作用，cAMP能夠通過cAMP相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)包括神經(jīng)元記憶、紋狀體可塑性、突觸等大腦功能，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療［34－36］。雒明池等［36］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柴胡－白芍藥對(duì)通過調(diào)節(jié)cAMP－cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）－腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）通路，增加慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）大鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)，改善大鼠抑郁樣癥狀。cAMP濃度與抑郁癥的發(fā)生有密切關(guān)系，增加cAMP濃度可以激活蛋白激酶A（PKA），從而激活特定基因轉(zhuǎn)錄，增加5－HT和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的含量，減輕模型大鼠的抑郁癥狀［37－38］。2）5－HT能突觸通路。5－HT又稱血清素，是一種內(nèi)源性單胺類物質(zhì)，廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等相關(guān)功能存在密切聯(lián)系。5－HT能夠發(fā)揮如此多而復(fù)雜的生物學(xué)功能，與其具有多種受體亞型有關(guān)。目前，5－HT受體已檢測(cè)出的約有13種，分布在不同的組織與器官內(nèi)。5－HT可以通過與這些組織與器官5－HT能突觸上不同亞型受體相結(jié)合，發(fā)揮不同的生理功能［39］。相關(guān)研究報(bào)道指出，5－HT能夠通過與不同受體結(jié)合，參與血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化、血小板活化、巨噬細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過程，干預(yù)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。研究表明，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病人中，5－HT含量與血管內(nèi)皮損傷程度呈正相關(guān)，5－HT可以與5－HT1B受體相結(jié)合誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈痙攣，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［40－41］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，5－HT與5－HT2A受體結(jié)合，通過增強(qiáng)促凝血活性，活化血小板，同時(shí)降低纖溶系統(tǒng)活性，從而促進(jìn)血小板聚集，致使大鼠動(dòng)脈收縮及損傷部位血栓形成［42］。研究還指出，5－HT通過參與酪氨酸蛋白激酶（PTK）－蛋白激酶C（PKC）－絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus酪氨酸激酶 2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）通路的調(diào)控，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)血管平滑肌增殖，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成［43］。此外，機(jī)體血漿中活性氧代謝物可以促使外周5－HT的表達(dá)，與5－HT2受體相結(jié)合，促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）－1β、IL－6等炎性因子的合成，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［44－45］。單胺神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說是抑郁癥發(fā)病的核心學(xué)說之一，5－HT作為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的一種，在抑郁癥發(fā)病中具有關(guān)鍵的作用。研究表明，大腦中5－HT通過作用于廣泛分布于中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)的5－HT受體，參與抑郁癥的發(fā)?。?6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明，大腦中5－HT7的過度表達(dá)，可以調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育、存活和凋亡，參與神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控的過程，導(dǎo)致抑郁樣行為的出現(xiàn)。而5－HT1AR受體能夠參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，降低大腦前額葉皮質(zhì)5－HT的表達(dá)水平，參與抑郁癥的發(fā)病。5－HT2CR受體主要分布于腦室脈絡(luò)叢、下丘腦、紋狀體、黑質(zhì)等部位，能夠通過降低DA及去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗抑郁作用。5－HT3R受體是一種由5個(gè)亞基組成的配體門控離子通道受體，腦組織其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放受到其異常表達(dá)的影響出現(xiàn)代謝異常，導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。5－HT受體家族龐大，但總體與抑郁發(fā)病機(jī)制的關(guān)系可概括為5－HT受體的過度表達(dá)干預(yù)了大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)病。

綜上所述，疏肝解郁安神方可能通過抗炎、抗氧化、抑制心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等生物學(xué)過程，起到治療冠心病合并抑郁狀態(tài)的作用。

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（收稿日期：2023－05－28）

（本文編輯王麗）

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No.81303073）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.192102310161，182102310291）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)（No.2016ZY3003，2021ZY1015，2021ZY2004）；河南省衛(wèi)生健康委員會(huì)基地專項(xiàng)課題（No.2021JDZY081，2021JDZY038）

通訊作者 閆奎坡，E－mail：ykp19821122@163.com

引用信息 陳瑞華，杜明遠(yuǎn)，郭雨晴，等.疏肝解郁安神方干預(yù)冠心病合并抑郁狀態(tài)的代謝組學(xué)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（12）：2113－2123.