甘蔗多酚的提取條件優(yōu)化及其抗氧化活性研究

摘要：以甘蔗糖蜜為原料通過大孔樹脂吸附法提取甘蔗多酚。以多酚提取量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并研究提取得到的甘蔗多酚的抗氧化活性。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝為pH值3.5、乙醇濃度50%、洗脫流速2.50 mL/min，在此條件下甘蔗多酚的提取量為（33.48±0.24） mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.04%。此外，ABTS和DPPH自由基清除率隨著甘蔗多酚質(zhì)量濃度的增加而上升，IC50值分別為824 μg/mL和2.51 mg/mL，1 mg/mL甘蔗多酚可還原2.88 μmol鐵離子當(dāng)量。試驗(yàn)結(jié)果表明甘蔗多酚具有較好的抗氧化活性，是一種天然抗氧化劑。該研究結(jié)果為甘蔗糖蜜的高值化利用和甘蔗多酚的開發(fā)利用提供了參考。

關(guān)鍵詞：甘蔗多酚；提取；響應(yīng)面分析法；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.2""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）11-0001-06

Optimization of Extraction Conditions and Antioxidant Activity

of Sugarcane Polyphenols

ZHAO Jian-wen， CUI Chun， XIONG Jian

（School of Food Science and Engineering， South China University of

Technology， Guangzhou 510640， China）

Abstract： Sugarcane polyphenols are extracted from sugarcane molasses by macroporous resin adsorption method. Using the extraction amount of polyphenols as the index， on the basis of single factor test， response surface method is used to optimize the extraction process， and the antioxidant activity of the extracted sugarcane polyphenols is studied.Response surface test results show that the optimal extraction process is pH value of 3.5， ethanol concentration of 50% and elution velocity of 2.50 mL/min. Under these conditions， the extraction amount of sugarcane polyphenols is （33.48±0.24） mg/g， and the relative error with the predicted value is 2.04%. In addition， the scavenging rates of ABTS and DPPH free radicals increase with the increase of the mass concentration of sugarcane polyphenols， and the IC50 values are 824 μg/mL and 2.51 mg/mL respectively.1 mg/mL sugarcane polyphenols could reduce 2.88 μmol iron ion equivalent. The test results show that sugarcane polyphenols have good antioxidant activity and they are a kind of natural antioxidant. The research results have provided references for the high-value utilization of sugarcane molasses and the development and utilization of sugarcane polyphenols.

Key words： sugarcane polyphenols; extraction; response surface analysis method; antioxidant activity

收稿日期：2024-04-08

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃（B17018）；水產(chǎn)品綠色加工與流通技術(shù)推廣與示范（B4220530）

作者簡(jiǎn)介：趙鍵文（1999—），男，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)；

熊犍（1965—），男，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

甘蔗糖蜜，又稱桔水，是一種深棕色黏稠狀液體。糖蜜成分十分復(fù)雜，糖是其主要成分，約占糖蜜重量的50%。除此之外，糖蜜中還富含多酚、有機(jī)酸、無機(jī)鹽、氨基酸、色素等[1]。甘蔗中多酚類化合物包括酚酸類（沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸和綠原酸等）、黃酮類（芹菜素、槲皮素、兒茶素和小麥黃酮等）、木質(zhì)素、芪類和單寧類[2-3]。糖蜜來源豐富、價(jià)格低廉，但自身開發(fā)難度大，目前多用作動(dòng)物飼料、建材填料、微生物發(fā)酵原料或用于回收糖分，經(jīng)濟(jì)價(jià)值低。

甘蔗多酚類物質(zhì)主要從甘蔗皮、甘蔗葉或甘蔗渣中提取[4]，回收利用甘蔗糖蜜中多酚類化合物的研究并不多。常用的提取方法有溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、大孔樹脂吸附法等[4]。大孔樹脂吸附法具有工藝簡(jiǎn)單、能耗少、綠色高效等優(yōu)點(diǎn)，因此在天然產(chǎn)物工業(yè)化分離中應(yīng)用廣泛。多酚類化合物具有抗氧化[5-11]、降血糖[12-17]、抗菌[18]和抗癌[19-22]等多種生理活性。研究發(fā)現(xiàn)甘蔗多酚是天然、抗氧化活性高的抗氧化劑，提取物的抗氧化能力與其多酚、黃酮含量息息相關(guān)。甘蔗糖蜜因蒸發(fā)濃縮效應(yīng)，其酚類和黃酮類化合物含量比甘蔗汁更高，被認(rèn)為是提取天然抗氧化劑的優(yōu)質(zhì)原料[7]。

本文以甘蔗糖蜜為原料，采用大孔樹脂吸附法，以乙醇-水溶液為洗脫劑提取多酚。試驗(yàn)中以多酚提取量為指標(biāo)，采取單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法探究其最佳提取工藝條件，并測(cè)定所提取多酚的抗氧化活性。本文旨在為甘蔗糖蜜的高值化利用和甘蔗多酚的提取提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

甘蔗糖蜜：廣西貴糖集團(tuán)股份有限公司；ADS-600樹脂：科海思（北京）科技有限公司；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海麥克林生化科技有限公司；維生素C：美國Sigma公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海源葉生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL21M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；THZ-C型恒溫培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；HL-2型恒流泵、XW-80A型旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SuperMax 3100型多功能酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；PHS-3E型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ME204E型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-765型紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；Scientz-18N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總多酚含量的測(cè)定

總多酚含量的測(cè)定按照國家衛(wèi)生健康委員會(huì)《關(guān)于萊茵衣藻等36種“三新食品”的公告》（2022年第2號(hào)）附錄A規(guī)定的方法進(jìn)行。

1.3.2 大孔吸附樹脂提取甘蔗多酚

甘蔗多酚的提取方法參考李晶博[23]的方法。經(jīng)過澄清處理的甘蔗糖蜜溶液通過大孔樹脂進(jìn)行吸附，采用超純水洗滌樹脂至流出液清澈透明，利用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為洗脫劑將糖蜜中的多酚洗脫；將洗脫液定容或濃縮凍干后測(cè)定多酚含量。

1.3.3 多酚提取單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 不同乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響

稱取5份ADS-600樹脂置于錐形瓶中，加入甘蔗糖蜜稀釋液10 mL，于37 ℃恒溫振蕩6 h；過濾取樹脂，用一定量蒸餾水沖洗樹脂，加入100 mL 40%、50%、60%、70%、80%乙醇進(jìn)行洗脫，37 ℃恒溫振蕩6 h。將獲得的洗脫液定容后，測(cè)定溶液中的多酚濃度，計(jì)算多酚提取量。

1.3.3.2 不同pH值對(duì)多酚提取量的影響

稱取5份ADS-600樹脂置于錐形瓶中，加入甘蔗糖蜜稀釋液10 mL，用HCl溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)各溶液的pH值分別為2，3，4，5，6，于37 ℃恒溫振蕩6 h；過濾取樹脂，用一定量蒸餾水沖洗樹脂，加入100 mL 50%乙醇進(jìn)行洗脫，于37 ℃恒溫振蕩6 h。將獲得的洗脫液定容后，測(cè)定溶液中多酚濃度，計(jì)算多酚提取量。

1.3.3.3 不同稀釋倍數(shù)對(duì)多酚提取量的影響

稱取5份ADS-600樹脂置于錐形瓶中，分別加入稀釋倍數(shù)為2.5，5，7.5，10，12.5的甘蔗糖蜜稀釋液，于37 ℃恒溫振蕩6 h；過濾取樹脂，用一定量蒸餾水沖洗樹脂，加入100 mL 50%乙醇進(jìn)行洗脫，于37 ℃恒溫振蕩6 h。將獲得的洗脫液定容后，測(cè)定溶液中多酚濃度，計(jì)算多酚提取量。

1.3.3.4 不同洗脫流速對(duì)多酚提取量的影響

稱取5份ADS-600樹脂填充于層析柱中，取一定量糖蜜稀釋液濕法上樣，進(jìn)行柱層析分離，用一定量蒸餾水沖洗樹脂，使用100 mL 50%乙醇分別以1，2，3，4，5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。將獲得的洗脫液定容后，測(cè)定洗脫液中多酚濃度，計(jì)算多酚提取量。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將糖蜜稀釋液的pH值、洗脫液的乙醇濃度、洗脫流速作為動(dòng)態(tài)吸附考察的3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)考察水平，通過Design-Expert 12.0軟件中響應(yīng)面法設(shè)計(jì)程序中的Box-Behnken方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.3.5 甘蔗多酚的抗氧化活性分析

1.3.5.1 ABTS自由基清除能力測(cè)定

ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照Asikin等[5]的方法。使用pH 7.4的PBS溶液配制5 mmol/L的ABTS母液，經(jīng)過95%乙醇稀釋后，使其在734 nm處的吸光度值為0.7±0.2（ABTS溶液現(xiàn)配現(xiàn)用）。隨后分別將 1 mL ABTS溶液和20 μL不同濃度梯度（400，800，1 200，1 600，2 000 μg/mL）的樣品溶液混勻，于室溫下避光放置 30 min，然后使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度值，其中以蒸餾水作為空白組，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照組。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

ABTS自由基清除率（%）=1-A1-A2A0×100%。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A2為對(duì)照組的吸光度值。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照Dargham等[15]的方法，分別將20 μL不同濃度梯度（1，2，3，4，5 mg/mL）的樣品溶液加入到1 mL DPPH乙醇溶液中混勻，在室溫下避光靜置30 min。隨后使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量其在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值，其中以蒸餾水作為空白組，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=1-A1-A2A0×100%。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A2為對(duì)照組的吸光度值。

1.3.5.3 FRAP總抗氧化能力測(cè)定

FRAP總抗氧化能力的測(cè)定參照Ali等[7]的方法并略作修改。首先分別取100 μL不同濃度梯度（200，400，600，800，1 000 μg/mL）的樣品溶液加入到3 mL FRAP工作液中，混合均勻后避光反應(yīng)30 min，然后測(cè)定其在593 nm處的吸光度值。以硫酸亞鐵溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，每次試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，采用SPSS 25.0、Origin 2019等作圖分析，以Tukey法在置信區(qū)間為95%下進(jìn)行顯著性分析。不同字母代表相同因素之間有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同單因素對(duì)多酚提取量的影響見圖1。

2.1.1 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響

由圖1中A可知，當(dāng)以不同濃度的乙醇溶液洗脫甘蔗多酚時(shí)，多酚提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到最大值31.35 mg/g。當(dāng)乙醇濃度由40%升至50%時(shí)，更多中極性多酚成分被提取出來；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，洗脫劑與多酚極性差異增大，使得多酚類物質(zhì)不能充分溶解，提取量反而減少[3，24]?？偟膩砜?，乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響較小。

2.1.2 pH值對(duì)多酚提取量的影響

由圖1中B可知，ADS-600樹脂在不同pH值的糖蜜稀釋液中吸附多酚時(shí)，多酚提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為4時(shí)達(dá)到最大值29.32 mg/g。由于酚類化合物呈現(xiàn)出弱酸性，因此其在弱酸性環(huán)境下更容易被吸附[14]。

2.1.3 不同稀釋倍數(shù)對(duì)多酚提取量的影響

由圖1中C可知，多酚提取量隨著甘蔗糖蜜稀釋倍數(shù)的升高而降低。糖蜜進(jìn)行預(yù)處理后的稀釋倍數(shù)為2.5倍，此時(shí)多酚提取量達(dá)到最大值，為30.02 mg/g；在吸附公式中，濃度與吸附量之間存在正相關(guān)性，稀釋倍數(shù)越小，濃度越大，多酚提取量越高[25]。

2.1.4 不同洗脫流速對(duì)多酚提取量的影響

由圖1中D可知，當(dāng)以不同的流速洗脫甘蔗多酚時(shí)，多酚提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在3 mL/min的流速條件下可達(dá)到最大值28.8 mg/g。一般來說，流速過小會(huì)降低生產(chǎn)效率，增加生產(chǎn)成本；而流速過大容易使大孔樹脂吸附多酚的效率降低，從而導(dǎo)致未被吸附的多酚流出層析柱[14]。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)ADS-600樹脂對(duì)甘蔗多酚動(dòng)態(tài)吸附洗脫工藝優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度（A）、pH值（B）和洗脫流速（C）設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，獲得多酚提取量對(duì)乙醇濃度（A）、pH值（B）、洗脫流速（C）的多元回歸方程：Y=32.44+0.32A-1.48B-0.672 5C-0.107 5AB+0.352 5AC+0.037 5BC-1.75A2-2.19B2-0.854 2C2。

該回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），方程的擬合性良好，操作誤差小，模型的重現(xiàn)性良好（R2=0.980 6，RAdj2=0.955 6，C.V.=1.39%），因此該響應(yīng)面設(shè)計(jì)可以用于優(yōu)化多酚動(dòng)態(tài)吸附洗脫工藝。由表3中各因素水平的顯著性可知，對(duì)多酚吸附洗脫工藝的影響主次順序?yàn)閜H值（B）＞洗脫流速（C）＞乙醇濃度（A）。

根據(jù)回歸方程得到的不同因素的二維等高線圖和3D響應(yīng)面圖見圖2。

圖2a中等高線圖呈近圓形，說明pH值和乙醇濃度的交互作用不明顯，P=0.624 7；圖2c中等高線圖呈近橢圓形，說明乙醇濃度與洗脫流速的交互作用不明顯，P=0.137 4；圖2e中等高線圖呈近橢圓形，說明pH值與洗脫流速的交互作用不明顯，P=0.863 4；與模型中F值的分析結(jié)果一致。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過回歸方程模型擬合分析，得到ADS-600大孔樹脂動(dòng)態(tài)提取甘蔗多酚的最佳工藝條件為pH值3.72、乙醇濃度50.69%、洗脫流速2.49 mL/min，該理論情況下多酚提取量為32.81 mg/g。綜合考慮，在實(shí)際操作中選擇pH值3.5、乙醇濃度50%和洗脫流速2.50 mL/min進(jìn)行洗脫。經(jīng)過3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的多酚提取量為（33.48±0.24） mg/g，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的結(jié)果比較接近，相對(duì)誤差僅為2.04%（lt;5%），試驗(yàn)值與理論值基本吻合。因此，該回歸方程模型可用于預(yù)測(cè)ADS-600大孔樹脂動(dòng)態(tài)提取甘蔗多酚。

2.4 甘蔗多酚的抗氧化活性分析

將甘蔗糖蜜在pH值3.5、乙醇濃度50%和洗脫流速2.50 mL/min的條件下進(jìn)行多酚的提取，經(jīng)濃縮冷凍干燥得到甘蔗多酚，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?jīng)測(cè)定，甘蔗多酚中總多酚含量為21.5%。

在甘蔗多酚的抗氧化活性測(cè)試中，由圖３可知，甘蔗多酚與VC對(duì)ABTS自由基的清除率、DPPH自由基的清除率和FRAP值均隨著質(zhì)量濃度的增加而升高，具有一定量效關(guān)系。甘蔗多酚與VC對(duì)ABTS自由基清除率的IC50值分別為824，228 μg/mL；對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值分別為2.51 mg/mL和199 μg/mL；當(dāng)甘蔗多酚濃度為1 mg/mL時(shí)可還原2.88 μmol的鐵離子當(dāng)量。甘蔗多酚對(duì)ABTS、DPPH自由基的清除能力和FRAP還原能力略低于陽性對(duì)照VC，但仍具有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本文以甘蔗糖蜜為原料，通過大孔樹脂吸附法提取甘蔗多酚。以多酚提取量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)獲得較優(yōu)提取條件，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并對(duì)提取得到的甘蔗多酚進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，較優(yōu)的提取條件為pH值4、糖蜜稀釋倍數(shù)越小越好、洗脫溶液乙醇濃度50%、洗脫流速3 mL/min。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝為pH值3.5、乙醇溶液濃度50%、洗脫流速2.50 mL/min，在此條件下獲得的甘蔗多酚提取量為（33.48±0.24） mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為2.04%。此外，經(jīng)測(cè)定，獲得的甘蔗多酚粉體中總多酚含量為21.5%。

甘蔗多酚抗氧化試驗(yàn)表明，ABTS和DPPH自由基清除率隨著甘蔗多酚質(zhì)量濃度的增加而升高，IC50值分別為824 μg/mL和2.51 mg/mL，甘蔗多酚為1 mg/mL時(shí)可還原2.88 μmol的鐵離子當(dāng)量，以上結(jié)果表明甘蔗多酚具有體外抗氧化活性。本研究結(jié)果為甘蔗糖蜜的高值化利用和甘蔗多酚的開發(fā)利用提供了參考。

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