巨桉脫水素基因EgrDHN家族鑒定及表達(dá)模式分析

摘 要：【目的】深入挖掘巨桉Eucalyptus grandis脫水素基因EgrDHN家族成員并探討其應(yīng)對逆境脅迫的表達(dá)模式，從中篩選具有抗逆功能的EgrDHN基因?qū)τ谂嘤駱淇鼓嫘缕贩N具有重要意義?！痉椒ā恳跃掼袢蚪M數(shù)據(jù)為參考，利用生物信息學(xué)篩選鑒定得到巨桉EgrDHN基因家族成員，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體包括進(jìn)化樹分析、蛋白序列比對、啟動子序列中順式作用元件預(yù)測等；并基于生物信息學(xué)分析結(jié)果，采用RT-qPCR測定方法，對EgrDHN基因家族成員在低溫、高鹽和ABA脅迫處理下的表達(dá)模式及其組織表達(dá)特異性進(jìn)行了分析?！窘Y(jié)果】從巨桉基因組中共鑒定出EgrDHN家族9個成員，將其命名為EgrDHN1～EgrDHN9，分布于5條染色體上，根據(jù)蛋白質(zhì)保守序列的特點可分為KnS、SKn和YnSKn 3種類型。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示植物DHN家族成員可分為4個進(jìn)化枝，其中第Ⅳ進(jìn)化枝包含巨桉EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，但不包含任何毛果楊Populus trichocarpa DHN同源基因（PtrDHNs），兩者存在明顯差異。啟動子元件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)巨桉EgrDHN啟動子中含有低溫響應(yīng)（Low-temperature response， LTR）元件，MYB、MYC等與抗逆性相關(guān)以及植物激素響應(yīng)類順式作用元件。組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)EgrDHN家族成員在根、成熟葉片、子葉中表達(dá)量較高，其中EgrDHN2在成熟葉片中表達(dá)量最高。非生物逆境脅迫下經(jīng)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)EgrDHN家族成員中，EgrDHN1在高鹽脅迫下表達(dá)量下調(diào)，在低溫和ABA脅迫時上調(diào)，而其他成員在低溫、高鹽、ABA脅迫下均表現(xiàn)為上調(diào)，其中低溫條件下以EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4響應(yīng)最為明顯?！窘Y(jié)論】大部分EgrDHNs基因參與逆境脅迫響應(yīng)，且除EgrDHN1在鹽脅迫下的表達(dá)量下降外其他成員在逆境脅迫下的表達(dá)量均上升。

關(guān)鍵詞：巨桉；脫水素；非生物脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號：S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）12-0166-12

基金項目：廣西重點研發(fā)計劃揭榜制科技項目（桂科JB22035001）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD23026337）。

Identification and expression pattern analysis of EgrDHN gene family in Eucalyptus grandis

SU Guofen1， LI Dahua2， WANG Pan1， ZHOU Liao2， HU Hao1， DENG Haiqun2， CHEN Xin1， FENG Mingkai2， GENG Xianchen1， WANG Yi1， XU Zengfu1

（1.a. College of Forestry；b. State Forestry and Grassland Administration Key Laboratory of Fast-Growing Timber Breeding in South China， Guangxi University， Nanning 530004， Guangxi， China； 2. State-owned Dongmen Forest Farm， Chongzuo 532108， Guangxi， China）

Abstract：【Objective】It is of great significance to explore the expression patterns of DHN gene family members in E. grandis and to screen the EgrDHN genes with stress resistance function for breeding new varieties of Eucalyptus.【Method】Based on the whole genome data of E. grandis， the EgrDHN gene family members were screened and identified by bioinformatics analysis， including phylogenetic tree analysis， protein sequence alignment， and promoter cis-acting element prediction.【Result】A total of 9 members of the DHN family were identified from the genome of E. grandis and named EgrDHN1-9， which were distributed on five chromosomes. The EgrDHN1-9 were divided into three types of KnS， SKn， and YnSKn， based on the conserved characteristics of their sequences. The phylogenetic tree showed that the plant DHN family could be divided into four evolutionary branches， among which the IV evolutionary branch contained EgrDHN7/8/9， but did not contain any P. trichocarpa DHN homologs （PtrDHN）， suggesting EgrDHNs and PtrDHN were significantly different from each other. Further analysis revealed that the promoters of EgrDHN mainly contained stress-responsive elements such as low-temperature response （LTR）， and the cisacting elements of stress-resistance related MYB， MYC and phytohormone-responsive genes. Tissue specific expression analysis found EgrDHN family members were highly expressed in roots， mature leaves， and cotyledons， with EgrDHN2 having the highest expression in mature leaves. RT-qPCR analysis revealed that the expression of EgrDHN1 in EgrDHN family members was down-regulated under high salt stress and up-regulated under low temperature and ABA stress， but the expression of other members were up-regulated under low temperature， high salt and ABA stress. Among them， EgrDHN2/3/4 showed the most obvious response at low temperature.【Conclusion】Most of EgrDHN genes are involved in stress response， and all members except EgrDHN1 are down-regulated under salt stress and may play a positive regulatory role.

Keywords： Eucalyptus grandis； dehydrin； abiotic stress； expression analysis

桉樹Eucalyptus spp.是我國南方重要的速生用材樹種，我國桉樹人工林面積有450多萬hm2，主要分布于廣西、廣東、福建、云南、海南等南方氣溫較高的10個省區(qū)，年產(chǎn)木材超過3 000萬m3，超全國木材總產(chǎn)量的1/3[1]。然而，桉樹的發(fā)展受限于逆境脅迫，如病蟲害等生物逆境脅迫極大影響桉樹的速生豐產(chǎn)[2]，低溫等非生物逆境脅迫是限制桉樹栽培區(qū)域的主要因素之一。解析桉樹對逆境脅迫抗性的生理和分子機制不僅對推廣種植具有很好的應(yīng)用價值，而且對培育桉樹抗逆優(yōu)良新品種、增加我國的木材產(chǎn)量、保障我國木材安全具有重要的意義。在桉樹的抗寒研究方面，美國ArborGen公司[3]對桉樹抗寒研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，并指出挖掘新的抗寒基因以及對常用抗寒基因的應(yīng)用是桉樹抗寒育種的重要方向。如將岡尼桉Eucalyptus gunnii的兩個轉(zhuǎn)錄因子EguCBF1a/b在冷敏感型尾巨桉E. urophylla×E. grandis（clone 201）中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)桉樹耐霜凍能力增強[4]。隨后對過表達(dá)尾巨桉株系的木質(zhì)部樣品做進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部特征與那些長期暴露于低溫環(huán)境的桉樹木質(zhì)部特征類似，表明在低溫脅迫下CBF對于林木發(fā)育和木材材性具有重要調(diào)控作用，因為木材材性的重塑是植物面對寒冷脅迫的適應(yīng)策略的一部分[5]。除響應(yīng)低溫脅迫外，過表達(dá)CBF還可以提高植物抵抗干旱和鹽脅迫的能力，如對35S：DREB1Ab（DREB1A/CBF3）和rd29A：DREB1Aa（DREB1A/ CBF3）轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行1 ℃ 10 d、25 ℃ 2 d的低溫處理及干旱2周的脅迫處理，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草較對照更耐低溫和干旱脅迫[6]。另外，codA是熟知的耐鹽基因，導(dǎo)入codA顯著提高了赤桉E. camaldulensis的耐干旱和鹽脅迫的能力[7-8]。

脫水素（Dehydrin， DHN）屬于植物胚胎發(fā)生后期豐富（Late embryogenesis abundant， LEA）蛋白，參與多種逆境脅迫響應(yīng)，該蛋白中含有Y、S、K 3個保守基序，其中Y-motif多處于DHN蛋白的N端，該基序可能具有類似分子伴侶的功能，可以幫助蛋白質(zhì)正確加工折疊以抵抗逆境脅迫[9-10]。S-motif由多個絲氨酸殘基串聯(lián)而成，可被酪蛋白激酶2磷酸化，并在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核[11]。K-motif通常位于DHN蛋白的C端，通過形成兩親性α-螺旋與膜結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞膜，以維持逆境脅迫下細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而提高植物的抗逆能力[12]。據(jù)報道，在擬南芥Arabidopsis thaliana中同時超量表達(dá)脫水素基因AtRAB18（At5g66400）、AtCOR47（At1g20440）和AtERD10（At1g20450）、AtXERO2（At3g50970）顯著提高植物的抗寒能力[13， 14]。在水稻Oryza sativa中過表達(dá)OsDHN1使水稻植株的抗寒和耐鹽性顯著增強[15]。擬南芥中過表達(dá)仙人掌Opuntia diuemii DHN1基因也提高了擬南芥對4 ℃低溫的耐受性[16]。此外，在擬南芥中過表達(dá)亮果桉E. nitens的EniDHN2基因增強擬南芥耐寒性，可見桉樹DHN基因家族具有改良植物抵抗低溫寒害的潛在應(yīng)用價值[17-18]。

除了提高抗寒能力以外，DHN基因家族成員還能在一些生物及非生物逆境脅迫下響應(yīng)表達(dá)，如疫霉病誘導(dǎo)櫟樹Quercus spp.的脫水素類似蛋白基因的表達(dá)[19]，在大腸桿菌Escherichia coli中過表達(dá)擬南芥AtERD10基因會抑制細(xì)菌生長[20]。在擬南芥中過表達(dá)毛果楊P. trichocarpa的PtrDHN3基因，在100 mmol/L NaCl溶液處理4周齡純合植株的試驗中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的H2O2和O2-積累量少于野生型，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性增強[21]。在辣椒Capsicum annuum中過表達(dá)CaDHN4基因，經(jīng)過4 ℃冷處理3 d和250 mmol/L NaCl處理下轉(zhuǎn)基因植株展現(xiàn)較低的MDA含量和電解質(zhì)，轉(zhuǎn)基因植株耐冷和耐鹽性增強[22]。類似地，在水稻Oryza sativa中異源表達(dá)JcDHN2可增強水稻植株對水分脅迫的耐受性[23]。

巨桉E. grandis作為我國主要造林雜交樹種尾巨桉和巨尾桉E. grandis×E. urophylla的親本，其具有生長迅速的特性，但其耐寒性較弱，致使其雜交桉樹種推廣受限[24]。因此，通過鑒定巨桉EgrDHN基因家族成員，并分析其不同脅迫如低溫、高鹽、ABA處理下的表達(dá)模式，從中篩選出與非生物脅迫抗性調(diào)控相關(guān)的DHN基因，既可以為研究這類基因的功能提供參考依據(jù)，也可為通過分子育種技術(shù)提高巨桉及其雜交種的抗逆性提供優(yōu)質(zhì)的候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗所用巨桉種子由廣西壯族自治區(qū)國有東門林場（廣西崇左市扶綏縣新寧鎮(zhèn)）提供。萌發(fā)后的幼苗種植于廣西大學(xué)林學(xué)院植物培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件參數(shù)設(shè)置：溫度28 ℃，光照20 000 lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 引 物

利用在線網(wǎng)站https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/index.cgi設(shè)計引物，并在上海生工生物有限公司與南寧擎科生物有限公司合成引物。引物母液濃度為10 μmol/L，反應(yīng)終濃度為0.2 μmol/L。所用引物序列信息詳見表1。

1.3 巨桉EgrDHN基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

巨桉的參考基因組信息、基因編碼序列和蛋白序列從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取。

利用已報道的擬南芥A. thaliana、毛果楊P. trichocarpa、水稻O. sativa的DHN基因家族成員蛋白序列作為查詢序列[15，25-26]，利用Tbtool軟件[27]比對巨桉的蛋白數(shù)據(jù)庫（E≤10-6），同時利用Hmmer網(wǎng)站（http：//hmmer.org/）的隱馬爾可夫模型PF00257比對巨桉蛋白庫數(shù)據(jù)，對以上兩種方法鑒定到的蛋白序列取并集，以并集內(nèi)的蛋白序列作為巨桉EgrDHN家族成員。

將篩選得到的EgrDHN家族成員蛋白序列提交至 ExPASY（https：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸長度（LEN）；利用巨桉基因組GFF注釋文件獲取巨桉EgrDHN家族成員在染色體中的定位信息，NCBI在線網(wǎng)址獲取外顯子數(shù)量及ORF長度；通過Plant-mPLoc（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測EgrDHN家族成員蛋白的亞細(xì)胞定位[28]。

1.4 巨桉EgrDHN生物信息學(xué)分析

根據(jù)擬南芥、毛果楊、水稻和巨桉的DHN基因家族編碼的蛋白序列，利用Mega5.0軟件進(jìn)行多序列比對，基于多序列比對結(jié)果采取鄰接法（Neighbor-joining）建樹，bootstrap參數(shù)設(shè)置為 1 000，其他參數(shù)默認(rèn)，再將文件提交至Itol在線網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/itol.cgi）進(jìn)行美化。

巨桉EgrDHN家族成員蛋白序列比對使用Snapgene軟件的Muscle功能進(jìn)行。

選取EgrDHNs基因序列的起始位點上游1 600 bp，提交至Plant CARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，得出的結(jié)果采用Excel軟件進(jìn)行整理，最后使用Tbtools和GraphPad Prism軟件繪圖。

1.5 巨桉EgrDHN基因家族表達(dá)模式分析

選取移栽后1月齡且長勢一致的巨桉幼苗，提取根、莖、葉、腋芽、頂芽和子葉的RNA，并反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR測定EgrDHN基因家族成員的表達(dá)模式。為消除生物鐘因素的影響，選擇同一時間進(jìn)行以下3種處理的取樣。

低溫處理：選取移栽后3月齡且長勢一致的巨桉幼苗，放置4 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，取樣時間依次為處理后的0、3、6、12、24和72 h。

NaCl處理：選取移栽后1月齡且長勢一致的巨桉幼苗，用濃度為150 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行土壤澆灌處理，取樣時間依次為處理后的0、3、6、12和24 h。

ABA處理：選取移栽后1月齡且長勢一致的巨桉幼苗，向葉片噴施濃度為100 μmol/L的ABA，取樣時間依次為處理后的0、3、6、12和24 h。

總RNA提取采用OMEGA的RNA提取試劑盒，cDNA第一鏈合成采用cDNA單鏈合成試劑盒（HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit），熒光定量PCR使用步驟按照SYBR Green染料法qPCR Mix說明書進(jìn)行。每個處理均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)整理

使用Excel 2010軟件整理實驗數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics（Version 20）SPSS 20進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，差異顯著設(shè)置為P<0.05，標(biāo)準(zhǔn)誤差反映樣本均值對總體均值的偏離程度。采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行作圖。

在測定基因表達(dá)量的實驗中，以EgrActin7基因作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨桉EgrDHN基因家族成員鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過多重序列比對以及隱馬爾可夫模型預(yù)測，從巨桉基因組中鑒定出9個DHN基因成員，這些基因隨機分布于巨桉11條染色體中的1號、2號、6號、9號和10號染色體上（表2）。其中9號染色體上含有4個成員、6號染色體兩個成員，1、2、10號染色體各一個成員。對9個成員的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)EgrDHN5/7/8/9定位于細(xì)胞質(zhì)中，其余5個成員定位于細(xì)胞核內(nèi)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示擬南芥、水稻、毛果楊P. trichocarpa和巨桉的DHN基因家族編碼的蛋白序列被分為5類（圖1），其中Ⅰ類進(jìn)化枝中包括水稻和擬南芥各1個成員、巨桉2個及毛果楊8個成員。Ⅱ類進(jìn)化枝中包括巨桉EgrDHN3/4/6成員，毛果楊僅有PtrDHN3。Ⅲ類進(jìn)化枝中包括擬南芥2個成員，毛果楊和巨桉分別包括2個、1個成員，且三個成員進(jìn)化距離較近。在Ⅳ類進(jìn)化枝中，包括巨桉3個成員，分別是EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，還包含擬南芥2個成員以及水稻6個成員，但沒有毛果楊PtrDHN。在所有分支中，Ⅴ類成員量最少，僅包括擬南芥的一個成員At3g50970。

2.2 巨桉EgrDHN家族成員蛋白質(zhì)序列比對

DHN家族通常含有Y、S、K三類保守基序，位于DHN蛋白質(zhì)C端的K-motif通常與植物抵抗低溫等逆境相關(guān)[17]。巨桉EgrDHNs蛋白序列比對結(jié)果表明，EgrDHN1、EgrDHN2屬于KnS型，其僅含有一個K-motif，位于氨基酸序列的中段。EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN6為SKn型，均含有兩個K-motif，其中一個K-motif位于C端。EgrDHN5、EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9屬于YnSKn型（圖2），它們同樣含有2個K-motif，其中EgrDHN5含有3個Y-motif，EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9只含有2個Y-motif，蛋白類型的分類結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化基本相符（圖2）。

2.3 啟動子順式作用元件分析

為探究EgrDHNs表達(dá)特性，對EgrDHNs起始密碼子上游1 600 bp啟動子中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)多處包含脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)類元件（圖3）。

對脅迫相關(guān)順式作用元件進(jìn)行分析（圖3-A、B），發(fā)現(xiàn)EgrDHN基因家族主要包含STRE、LTR、MBS、TC-rich repeats、O2-site、MYC、MYB、GC-motif、DRE core和ARE等10種類型順式作用元件。其中EgrDHN2/6/8的啟動子中含有響應(yīng)低溫的LTR元件（low temperatureresponsive element，LTR），EgrDHN4/8啟動子中含有缺氧特異性誘導(dǎo)元件GC-motif。大部分EgrDHNs基因的啟動子中含有厭氧誘導(dǎo)相關(guān)元件ARE（anaerobic induction element），以及MYB、MYC等抗逆性相關(guān)順式作用元件。

對激素響應(yīng)元件進(jìn)行分析（圖3-C、D）發(fā)現(xiàn)，EgrDHNs啟動子中主要存在脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、生長素響應(yīng)元件（AuxRR-core、TGA）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA、SARE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif），每個成員的啟動子中都至少含有兩種上述響應(yīng)元件，其中以脫落酸響應(yīng)元件ABRE數(shù)量最多。

2.4 巨桉EgrDHNs在各組織器官中的表達(dá)特征

為了研究巨桉EgrDHNs的組織表達(dá)特異性，利用實時熒光定量PCR檢測了9個EgrDHN家族成員在巨桉幼苗的根、莖、葉、頂芽、腋芽、子葉6個組織器官中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示EgrDHN1、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN5、EgrDHN6、EgrDHN7主要在根中表達(dá)；EgrDHN2在各器官中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)最高；EgrDHN3在子葉和莖中低豐度表達(dá)，在腋芽中表達(dá)量最低；EgrDHN6主要在根中表達(dá)，子葉和莖中表達(dá)量最低；EgrDHN8、EgrDHN9主要在子葉中表達(dá)（圖4）。

2.5 逆境脅迫下巨桉EgrDHNs的表達(dá)分析

在啟動子元件預(yù)測中發(fā)現(xiàn)EgrDHN家族成員的啟動子中含有與低溫脅迫響應(yīng)元件LTR、脫落酸響應(yīng)元件ABA、干旱響應(yīng)元件DRE core等相關(guān)元件，其中LTR元件與抵抗低溫寒害相關(guān)，ABA則參與多種逆境脅迫響應(yīng)，DRE core元件通過抵抗植物脫水而使植物免受損傷，為檢測EgrDHNs成員對低溫、ABA、高鹽脅迫下的響應(yīng)程度，對巨桉分別進(jìn)行如下三種脅迫處理。

首先，在4 ℃下對巨桉幼苗分別進(jìn)行不同時間的低溫處理，然后收集葉片進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EgrDHN1、EgrDHN6、EgrDHN7在低溫處理0～24 h內(nèi)表達(dá)量很低，在48 h時達(dá)到最高表達(dá)量，隨后在72 h時表達(dá)量減弱。EgrDHN2的表達(dá)量在處理48 h時達(dá)到最高，處理72 h時略微降低。EgrDHN3和EgrDHN4在處理24 h時表達(dá)量最高，隨后降低。EgrDHN5處理后表達(dá)量下降，在48 h時才開始上升，72 h時表達(dá)量達(dá)最大值。EgrDHN8在處理0～12 h期間表達(dá)量極低，24 h時表達(dá)量開始上升，在48 h時達(dá)到最大后又開始下降。EgrDHN9在處理的第6 h時開始上升，12 h時達(dá)最大，隨后也開始下降。上述結(jié)果說明EgrDHN基因家族成員均能受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，盡管僅有EgrDHN2/6/8啟動子中含有LTR元件，但可能通過MYB、MYC等其他元件響應(yīng)低溫誘導(dǎo)（圖5）。

其次，使用150 mmol/L NaCl溶液對巨桉幼苗灌根處理不同時間后對葉片進(jìn)行取樣，通過RTqPCR測定EgrDHNs的表達(dá)模式。表達(dá)結(jié)果顯示，EgrDHN1在處理后3～24 h表達(dá)量下降。EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN7在處理的第6 h時才上升至最大，但隨后在12 h和24 h下降。EgrDHN6、EgrDHN8、EgrDHN9在處理的第3 h時表達(dá)量上升到最大值，隨后在6～24 h表達(dá)量均較低。EgrDHN5在處理后3 h表達(dá)量升高至最大，隨后下降（圖6）。上述結(jié)果表明，巨桉EgrDHN基因家族中除EgrDHN1不受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其余成員均可響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

最后，使用100 μmol/L ABA對巨桉幼苗葉片噴施處理不同時間后對葉片進(jìn)行取樣，通過RT-qPCR測定EgrDHNs表達(dá)模式。結(jié)果表明，EgrDHN1、EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN6、EgrDHN9在處理第6 h時表達(dá)量上升且達(dá)到最大值；EgrDHN5、EgrDHN8在第3 h時上升，隨后下降；EgrDHN7處理后表達(dá)量開始上升，至12 h時上升到最大值，隨后下降（圖7）。上述結(jié)果表明，所有巨桉EgrDHNs基因均能響應(yīng)ABA誘導(dǎo)。

3 討 論

巨桉作為全球9大主栽桉樹種之一，在熱帶及亞熱帶地區(qū)引種非常成功[29]，因其生長迅速、干形通直飽滿而作為最主要的人工用材林樹種之一，對其抗逆性研究有助于進(jìn)一步推廣種植。本研究從巨桉中鑒定了9個EgrDHN家族成員，這與大多數(shù)物種的DHN基因家族成員數(shù)量相近。目前，在毛果楊[26]、擬南芥[25]、水稻[15]、獼猴桃[30]、蘋果[31]、葡萄[32]、梨樹[33]、藍(lán)桉[34， 35]和岡尼桉[36]等物種均發(fā)現(xiàn)脫水素與抗逆性相關(guān)，但在巨桉中尚未針對脫水素基因家族展開系統(tǒng)性研究。

本研究發(fā)現(xiàn)巨桉EgrDHN家族與毛果楊、擬南芥均存在較大差異，功能可能不保守。首先，Ⅰ類進(jìn)化枝中巨桉僅有EgrDHN1、EgrDHN2兩個成員，擬南芥和水稻均只含一個成員，毛果楊則有8個成員，且8個成員中Kn型占5/8，在其他植物中Kn型多與低溫、ABA等有關(guān)，直接響應(yīng)冷馴化過程[18，37]，同時，擬南芥At1g54410具有防止重金屬脅迫造成植物生理損害的功能[38]，巨桉EgrDHN1、EgrDHN2基因編碼蛋白與上述基因的編碼蛋白進(jìn)化關(guān)系較近，可能具有抵抗冷害功能，但是否具有抵御重金屬脅迫的功能還有待于研究。其次，Ⅱ類進(jìn)化枝中所有成員均為SKn型，其中僅含毛果楊PtrDHN3一個成員，先前研究發(fā)現(xiàn)不同楊樹中只有一個SKn型DHN基因，且能夠響應(yīng)多種逆境[39-40]，在擬南芥中異源表達(dá)毛果楊PtrDHN3增強擬南芥耐鹽性。本研究發(fā)現(xiàn)毛果楊PtrDHN3與巨桉EgrDHN3、EgrDHN4處于同一分支，因此推測巨桉中EgrDHN3、EgrDHN4基因具有類似的抗逆功能，但是否存在功能冗余還有待于進(jìn)一步研究。

巨桉大部分EgrDHNs成員在根系中表達(dá)量較高（圖4），可能與根系水分吸收功能相關(guān)。脫水素在根部表達(dá)能夠有效抑制根系水分吸收失調(diào)導(dǎo)致的植物細(xì)胞損害[41]。EgrDHN6在根、葉、腋芽部位組成型高表達(dá)，在子葉和莖中低表達(dá)，說明其可能不受早期發(fā)育過程調(diào)控，而EgrDHN8、EgrDHN9在子葉中高表達(dá)，推測其可能在早期發(fā)育中發(fā)揮作用。與其他成員不同的是EgrDHN2在所有組織部位中均高表達(dá)，尤其是葉片中表達(dá)量最高，這與水稻OsDHN2表達(dá)結(jié)果一致[42]，預(yù)測其在整個植株發(fā)育過程均發(fā)揮功能。在所有基因家族成員中沒有發(fā)現(xiàn)在莖中特異性表達(dá)的成員，分析可能是因為植物莖為木質(zhì)結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)輸送營養(yǎng)，對脫水脅迫不敏感。

巨桉EgrDHN家族成員參與調(diào)控抗逆的方式具有獨特性。先前文獻(xiàn)報道，YnSKn型響應(yīng)高鹽和干旱脅迫，Kn型、SKn型、KnS型響應(yīng)低溫脅迫[25]，這與本實驗結(jié)果有輕微差別。在本試驗中除YnSKn型響應(yīng)高鹽表達(dá)外，KnS型EgrDHN2也響應(yīng)表達(dá)，但KnS型EgrDHN1受脅迫后反而下調(diào)，在低溫脅迫下YnSKn型也會響應(yīng)表達(dá)（圖5～6）。在低溫、高鹽、外源ABA處理下，除了EgrDHN1在高鹽脅迫下會下調(diào)，其他巨桉EgrDHNs基因均能被誘導(dǎo)表達(dá)，尤為明顯的是EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4。在啟動子順式作用元件預(yù)測分析中（圖3）發(fā)現(xiàn)僅EgrDHN2、EgrDHN6、EgrDHN8存在低溫響應(yīng)元件LTR，說明除LTR外還存在其他響應(yīng)低溫脅迫的元件。此外，在EgrDHNs啟動子元件中發(fā)現(xiàn)大部分成員均含有ABA的響應(yīng)元件ABRE，通過外源ABA處理巨桉幼苗后EgrDHN基因家族也均能響應(yīng)表達(dá)，其中EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4響應(yīng)程度較高，但在調(diào)控元件預(yù)測中EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9含ABRE數(shù)量較多，說明除ABRE外可能還會通過其他途徑來響應(yīng)外源ABA的處理。

4 結(jié) 論

本研究從巨桉全基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出9個EgrDHN家族成員，依據(jù)其在染色體中的定位依次命名為EgrDHN1～EgrDHN9。蛋白質(zhì)序列比對表明巨桉EgrDNHs各成員之間結(jié)構(gòu)域比較保守，根據(jù)Y、S、K保守結(jié)構(gòu)域片段的數(shù)量及位置可將其分為KnS、SKn和YnSKn三種類型。此外，結(jié)合順式作用元件分析及低溫、ABA以及NaCl脅迫處理后的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該家族成員多數(shù)響應(yīng)低溫、ABA以及NaCl脅迫，其中EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4的響應(yīng)尤為敏感，這3個基因可能在調(diào)控巨桉抗逆性方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為后續(xù)深入探究桉樹EgrDHNs基因功能及通過基因工程改良桉樹的性狀提供候選基因。

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[本文編校：戴歐琳]