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    西康扁桃仁中β-谷甾醇檢測方法的建立

    2024-06-01 11:48:47朱子冬李仁愛魯澤立程瀟瀟田榮榮
    北京城市學(xué)院學(xué)報 2024年2期
    關(guān)鍵詞:谷甾醇含量測定高效液相色譜法

    朱子冬 李仁愛 魯澤立 程瀟瀟 田榮榮

    摘? 要:

    西康扁桃仁中植物甾醇含量豐富,且以β-谷甾醇為主。通過高效液相色譜法檢測波長、流動相配比、流速、柱溫等條件,確定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量測定的最佳條件為檢測波長201 nm,流動相為100%甲醇,流速1.0 mL/min,色譜柱溫度40℃。方法學(xué)考察結(jié)果表明,該方法線性關(guān)系良好,精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD值均小于2.0%,平均加標(biāo)回收率106.14%,該方法穩(wěn)定可靠,可用于西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量測定。

    關(guān)鍵詞:西康扁桃仁;β-谷甾醇;高效液相色譜法;含量測定

    中圖分類號:TS207.3

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A? 文章編號:1673-4513(2024)-02-102-06

    收稿日期:2023年03月12日

    作者簡介:

    朱子冬(1996-),男,北京人,助理實驗師,學(xué)士,主要研究方向:食品質(zhì)量檢測技術(shù)。

    通信作者:

    田榮榮(1982-),女,山東榮成人,教授,博士,主要研究方向:食品質(zhì)量與安全。

    基金項目:

    北京城市學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(202211418019)。

    引言

    西康扁桃(Amygdalus tangutica (Batal.) Korsh.) 又名四川扁桃、甘肅山毛桃等,薔薇科[1-2],密生落葉小灌木,主要產(chǎn)自甘肅南部和四川西南部,是唯一分布在我國南方的野生扁桃種[3]。作為我國特有的木本油料植物,西康扁桃同時還是一種重要的天然食品添加劑及醫(yī)藥原料,具有很高的開發(fā)潛力。

    植物甾醇是一種植物中存在的甾體化合物,幾乎所有的植物性食物中均有分布。至今已發(fā)現(xiàn)的植物甾醇的種類數(shù)量超過250種,它們遍及各種植物性食物,含量最多且最為普遍的是豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇以及菜油甾烷醇 [4]。植物甾醇不但抗氧化活性強(qiáng),同時具有抑制膽固醇的吸收、降低血脂免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理功效[5]。西康扁桃仁中植物甾醇含量超過300 mg/100g,其中β-谷甾醇含量豐富,占80%左右[3]。

    β-谷甾醇是以環(huán)戊烷全氫菲為基本骨架的四環(huán)三萜類化合物,其分子結(jié)構(gòu)與膽固醇相近,主要區(qū)別在C-17及C-24上的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致兩者具有不同的生理活性。作為重要的天然甾醇資源,β-谷甾醇具有消炎、抗氧化、降血壓、降血脂等多種藥理活性和生理功能[5-6]。目前,β-谷甾醇的含量測定方法主要有雙波長薄層掃描法[7]、薄層色譜掃描法、高效液相色譜-ELSD[8]、高效液相色譜法等[9-10]、氣相色譜法[11]等。其中高效液相色譜法操作簡便,只需皂化和萃取等手段,即可直接進(jìn)樣,無需對樣品進(jìn)行衍生化,同時具有靈敏度高,準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,應(yīng)用較廣。本實驗擬建立一種簡單、快捷的高效液相色譜法對西康扁桃中β-谷甾醇含量進(jìn)行測定,為西康扁桃種質(zhì)資源的充分利用提供方法學(xué)支持。

    一、實驗材料及儀器

    (一)實驗材料及試劑

    實驗中所使用的西康扁桃由林科院提供,采自四川省阿壩州松潘縣,取仁,冷藏。

    β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥99%),北京索萊寶科技有限公司。

    乙酸乙酯,北京市通廣精細(xì)化工公司;無水乙醇,北京市通廣精細(xì)化工公司;95%乙醇,江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;氫氧化鉀,北京化學(xué)試劑公司;甲醇,北京西朧科學(xué)股份有限公司;其中甲醇為色譜純,其余試劑為分析純。

    西康扁桃仁中β-谷甾醇檢測方法的建立

    (二)實驗儀器

    CTO-16高效液相色譜儀,島津儀器(蘇州)有限公司;色譜柱為C18 Inertsil ODS-3(4.6 nm × 250 nm, 5 μm);98-I-B型電子分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司;B-260電熱恒溫水浴鍋,上海亞榮生化儀器廠;MDF-86V340 -20℃冰箱,中科都菱科技有限公司;DL-101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,天津中環(huán)實驗電爐有限公司;200多功能粉碎機(jī),武義意中廚具有限公司;KQ5200DB超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

    二、實驗方法

    (一)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

    精密稱取β-谷甾醇對照品10 mg,置于10 mL容量瓶,加入甲醇超聲溶解,并定容至刻度線,用有機(jī)微孔濾膜(0.45 μm)過濾,取濾液,得1.0 mg/mLβ-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

    (二)樣品溶液的制備

    西康扁桃仁去皮干燥粉碎,加入定量的乙酸乙酯,超聲提取后獲得扁桃仁油,稱取適量扁桃仁油于三角瓶中加入濃度為20%的氫氧化鉀-乙醇溶液,隨后水浴加熱使其皂化,萃取得到植物甾醇粗提物,并加適量流動相溶解殘渣,得供試品溶液。

    (三)β-谷甾醇檢測條件的摸索

    1.檢測波長的選擇

    配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。使用TU-1900紫外分光光度計,設(shè)置掃描波長為190 nm ~ 300 nm,對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長掃描,根據(jù)吸光值的變化,確定β-谷甾醇的檢測波長。

    2.流動相的選擇

    配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,分別設(shè)置流動相為100%甲醇,甲醇一水的比例為955,甲醇一水的比例9010,選用二(三)1確定的檢測波長,流速為1.0 mL/min,柱溫設(shè)為35℃,進(jìn)樣量為10 μL,根據(jù)樣品的保留時間及峰型,確定流動相配比。

    3.流速的選擇

    配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,選用二(三)1確定的檢測波長及二(三)2確定的流動相,分別以0.8、1.0、1.2 mL/min 的流速分析β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,柱溫設(shè)為35℃,進(jìn)樣量為10 μL,根據(jù)樣品的保留時間及峰型,確定流速。

    4.柱溫的選擇

    配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液選用二(三)1確定的檢測波長、二(三)2確定的流動相及二(三)3確定的流速,分別設(shè)柱溫為30℃、35℃、40℃、45 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,根據(jù)樣品的保留時間及峰型,確定柱溫。

    (四)β-谷甾醇檢測方法的可靠性考察

    1.線性關(guān)系考察

    分別配制濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)液。按上述色譜條件檢測,考察標(biāo)準(zhǔn)液濃度與峰面積間的線性關(guān)系。

    2.精密度考察

    分別吸取同一對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察該方法的精密度。

    3.穩(wěn)定性考察

    取樣品溶液,室溫下放置0、4、8、12、24 h,分別進(jìn)樣,考察該樣品在24 h內(nèi)室溫下的穩(wěn)定性。

    4.加標(biāo)回收率考察

    取樣品溶液10份,取其中的一份進(jìn)行上機(jī)檢測β-谷甾醇含量,分別配制低、中、高3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入后9份樣品中,按照同樣方法上機(jī)測定,計算加標(biāo)回收率。

    (五)西康扁桃仁中β-谷甾醇含量的檢測

    利用二(二)的方法制備樣品溶液,利用建立的HPLC檢測方法,檢測并計算西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量。

    三、實驗結(jié)果

    (一)β-谷甾醇高效液相色譜條件的摸索結(jié)果

    1.檢測波長的確定

    如圖1所示,190 nm ~ 300 nm范圍內(nèi)β-谷甾醇的吸光值呈明顯的先升高后降低趨勢,在波長201 nm處達(dá)到最高峰,

    A~C 流動相分別為甲醇100%、甲醇水為955、甲醇-水為9010

    A~C 流速分別為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min

    故選擇波長為201 nm為檢測波長。

    2.流動相的確定

    如圖2所示,當(dāng)流動相為100%甲醇時,出峰時間快,峰寬比較窄,峰型最為對稱,因此選擇100%甲醇為流動相。

    3.流速的確定

    如圖3所示,當(dāng)流速為1 mL/min時,出峰時間較快,峰形對稱,當(dāng)流速增加至1.2 mL/min時,雖然保留時間更短,但在檢測樣品時與其他雜峰無法達(dá)到完全分離,因此選擇1 mL/min流速最為適宜。

    4.柱溫的確定

    如圖4所示,當(dāng)柱溫為40℃時,峰型相對最為對稱,出峰時間較快,峰寬比較窄,且檢測樣品時與雜峰可達(dá)到完全分離,因此柱溫選擇40℃。

    A~D 柱溫分別為30℃、35℃、40℃、45℃

    (二)β-谷甾醇高效液相色譜檢測方法的

    考察結(jié)果

    1.線性關(guān)系和方法精密度考察結(jié)果

    圖5所示,以β-谷甾醇濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到相關(guān)方程y=5326472x - 42712,相關(guān)系數(shù)R2為0.9995,說明β-谷甾醇在 20~500 μg/mL內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系其回歸性較好,可進(jìn)行β-谷甾醇的定量分析。

    如表1所示,同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次,平行性較好, RSD值為0.75%,表明該方法精密度良好。

    2.樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果

    如表2所示,24小時內(nèi)檢測β-谷甾醇含量差異較小,RSD值僅為1.87%,說明在室溫條件下樣品24小時內(nèi)較為穩(wěn)定。

    3.樣品加標(biāo)回收考察結(jié)果

    如表3所示,加標(biāo)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,樣品回收率在94.13% ~ 115.73%范圍內(nèi) ,平均回收率為106.14%。研究表明,該方法回收率良好,可用于樣品的測定。

    (三)西康扁桃樣品中β-谷甾醇含量的測定

    采用優(yōu)化后的液相色譜條件檢測西康扁桃仁樣品中β-谷甾醇含量,色譜圖如圖6所示,重復(fù)三次,含量平均值為253.56 mg/100g。

    結(jié)語

    本實驗采用高效液相色譜法檢測西康扁桃仁中β-谷甾醇含量,分別優(yōu)化了流動相、流速、柱溫等色譜條件,并通過線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收等方法學(xué)考察,結(jié)果表明當(dāng)檢測波長為201 nm,流動相為100%甲醇,流速為1 mL/min,柱溫為40℃時,用時較短,線性關(guān)系及精密度良好,回收率高,可用于測定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量。本實驗未對β-谷甾醇的提取條件進(jìn)行考察,未來可進(jìn)一步優(yōu)化提取過程,使西康扁桃仁中β-谷甾醇資源得以更充分地利用。

    參考文獻(xiàn):

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    [2]王春成, 張云玲, 馬松梅, 等.中國扁桃亞屬四種野生扁桃的系統(tǒng)發(fā)育與物種分化 [J].植物生態(tài)學(xué)報, 2021, 45(9): 987-995.

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    Establishment of a method forβ-sitosterol determination

    in Xikangalmond

    ZHU Zidong, LI Renai, LU Zeli, CHENG Xiaoxiao, TIANRongrong

    (School of Biomedicine, Beijing City University,Beijing 100094, China)

    Abstract:

    The phytosterol content in Xikang almond kernels is rich and dominated by β-sitosterol. By exploring the conditions such as wavelength, mobile phase ratio, flow rate and column temperature detected by high-performance liquid chromatography, the content of β-sitosterol in Xikang almond kernel was determined. The optimal conditions for the determination of β-sitosterol content are detection wavelength of 201 nm, mobile phase of 100% methanol, flow rate of 1.0 mL/min and chromatographic column temperature of 40 ℃. The methodological investigation results indicate that the method has a good linear relationship with RSD values of precision repeatability and stability are less than 2.0%, and an average spiked recovery rate is 106.14%. The method is stable and reliable which can be used for the content determination of β-sitosterol in Xikang almond kernel.

    Keywords:

    Xikang almond; β-sitosterol; high performance liquid chromatography; content determination

    (責(zé)任編輯:劉艷麗)

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