超聲輔助提取花椒精油及抗氧化活性分析

張瑩麗 柳亞文 楊紅應(yīng) 嚴(yán)露露 馮世杰 陳麗文

摘要：文章采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取花椒精油，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定提取花椒精油的最佳工藝條件為原料粒度50目、料液比1∶15、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間60 min，在此條件下精油得率達(dá)2.61%。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析最佳工藝條件下提取的精油的化學(xué)成分，結(jié)果顯示花椒精油主要含檸檬烯（18.267%）、4-萜烯醇（10.625%）、月桂烯（10.009%）、α-松油醇（8.199%）、乙酸松油酯（6.499%）、3-莰烯（6.512%）等?？寡趸钚匝芯拷Y(jié)果表明，花椒精油對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基有很好的清除效果，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)最高清除率分別可達(dá)到72.5%和80.6%。

關(guān)鍵詞：超聲輔助提取；花椒精油；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS264.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）02-0186-06

Ultrasonic-Assisted Extraction of Essential Oil from ?Zanthoxylum bungeanum Maxim. and Analysis of Its Antioxidant Activity

Abstract： In this paper， the essential oil is extracted from Zanthoxylum bungeanum Maxim. by ultrasonic-assisted steam distillation method. Through single factor test and orthogonal test， the optimum process conditions for the extraction of essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim. are determined as follows： the particle size of the raw material is 50 mesh， the ratio of solid to liquid is 1∶15， the ultrasonic temperature is 50 ℃ and the ultrasonic time is 60 min. The yield of essential oil reaches 2.61% under such conditions. The chemical components of the essential oil extracted under the optimum process conditions are analyzed by gas chromatograph-mass spectrometer. The results show that the essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim. mainly contains limonene （18.267%）， 4-terpenol （10.625%）， myrcene （10.009%）， α-terpineol （8.199%）， terpinyl acetate （6.499%） and 3-camphene （6.512%）. The research results of antioxidant activity show that Zanthoxylum bungeanum Maxim. essential oil has good scavenging effects on DPPH free radicals and superoxide anion free radicals， and the highest scavenging rates could reach 72.5% and 80.6% respectively in the test concentration range.

Key words： ultrasonic-assisted extraction; Zanthoxylum bungeanum Maxim. essential oil; extraction process; antioxidant activity

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）為蕓香科花椒屬落葉小喬木[1-2]，花椒果皮中富含揮發(fā)油[3]，可通過水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法、微波輔助法、超聲波輔助法等方法提取花椒精油[4-6]，其主要活性成分有檸檬烯、月桂烯、羅勒烯、4-萜烯醇、α-松油醇、芳樟醇等[7-9]，具有殺菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲等作用[10-11]，花椒精油的活性成分可通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）來進(jìn)行分離分析和定性定量檢測(cè)[12]。本試驗(yàn)以花椒為原料，采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取花椒精油，通過GC-MS對(duì)花椒精油的組成成分進(jìn)行分析，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為花椒精油的提取、成分分析、抗氧化活性研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

紅花椒：產(chǎn)地四川漢源，廠家為玉林市升鼎聚原生中草藥有限公司。

1.2 試劑

抗壞血酸（VC）、無水乙醇（均為分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；DPPH、Tris-HCl、鄰苯三酚（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；800Y高速多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；6890N-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技公司；V-1800紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；KDM調(diào)溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 花椒預(yù)處理

取一定量干花椒，放入多功能粉碎機(jī)中粉碎后過篩，置于陰涼干燥處密封保存?zhèn)溆肹13]。

1.4.2 精油提取率的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取20 g花椒粉末，提取條件初步選擇原料粒度40目、料液比1∶10、超聲時(shí)間90 min、超聲溫度60 ℃，計(jì)算提取率[14]，之后密封避光4 ℃保存。

花椒精油提取率的計(jì)算公式：

精油提取率（%）=花椒精油的質(zhì)量/花椒樣品的質(zhì)量×100%。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)選取原料粒度、料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間為單因素，研究原料粒度（20，30，40，50，60目）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、超聲溫度（20，30，40，50，60 ℃）、超聲時(shí)間（30，60，90，120，150 min）對(duì)花椒精油提取得率的影響，以精油得率為依據(jù)，得出4個(gè)單因素的較優(yōu)提取水平。

1.4.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)原料粒度、料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)單因素選取3個(gè)適宜水平，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。對(duì)精油提取得率進(jìn)行對(duì)比，從而獲得最佳提取工藝。

1.4.5 花椒精油GC-MS組分分析

1.4.5.1 樣品制備方法

樣品用甲醇稀釋50倍。

1.4.5.2 GC-MS組分分析

采用GC-MS分析法，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)鑒定成分[15-16]，GC-MS分析條件如下：

色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫60 ℃，柱流量0.9 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱前壓6.97 psi，進(jìn)樣量1.0 μL，載氣He，分流比50∶1，流速0.9 mL/min，程序升溫：柱溫60 ℃（初始柱溫保持3 min），以5 ℃/min升至250 ℃，保持12 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源（70 eV），雙燈絲，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，掃描范圍（m/z）：40～500 u，譜圖檢索：NIST 14譜庫。

1.4.6 抗氧化試驗(yàn)

1.4.6.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

精確稱取6 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，得到60 μmol/L的DPPH-乙醇溶液；于4 ℃避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用，4 h之內(nèi)有效。將花椒精油用無水乙醇稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10 mg/mL的待測(cè)液[17]。

取1 mL待測(cè)液、1 mL無水乙醇，分別將其與1 mL DPPH-乙醇溶液混合，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光度，分別記為A1和A2；取1 mL待測(cè)液與1 mL無水乙醇混勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度A0，用無水乙醇調(diào)零，以VC為陽性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

DPPH 自由基清除率（%）=[1－（A1－A0）/A2]×100%。

1.4.6.2 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液4.5 mL，于25 ℃水浴20 min，分別加入1.00 mL不同濃度的樣品溶液和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.40 mL，混勻后于25 ℃水浴反應(yīng)5 min，加入1.00 mL 8 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)吸光度[18]。以VC為陽性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

超氧陰離子自由基清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%。

式中：A1表示含有樣品和鄰苯三酚的溶液的吸光度；A2表示含有樣品、不含鄰苯三酚的溶液的吸光度；A0表示不含樣品、含有鄰苯三酚的溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料粒度對(duì)花椒精油得率的影響

由圖1可知，隨著原料粒度的增大，花椒精油得率隨之增大，在20～50目范圍內(nèi)，花椒精油得率呈逐漸上升趨勢(shì)。當(dāng)原料粒度為50目時(shí)精油得率最高，60目時(shí)精油得率急劇下降，可能是由于花椒粉碎粒度太小，精油提取不完全。

2.1.2 料液比對(duì)花椒精油得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增大，精油得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)精油得率最高，繼續(xù)增加料液比，得率逐漸下降，可能是由于料液比過大，花椒精油在水中的溶解度增大，進(jìn)而導(dǎo)致精油產(chǎn)率下降。

2.1.3 超聲溫度對(duì)花椒精油得率的影響

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度為20～40 ℃時(shí)，精油得率呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度達(dá)到40 ℃時(shí)精油得率最高，40～60 ℃時(shí)，精油得率隨著溫度的升高而逐漸降低，因此，40 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)花椒精油得率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間為30～90 min時(shí)，花椒精油得率呈上升趨勢(shì)，90 min時(shí)精油得率最高，時(shí)間小于90 min，超聲時(shí)間太短，花椒中的精油不能被完全提取出來。時(shí)間大于90 min，精油得率呈遞減趨勢(shì)，因此90 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，影響花椒精油得率的因素主次順序?yàn)镈>A>C>B。花椒精油得率最高的試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即原料粒度50目，料液比1∶15，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間60 min。理論最優(yōu)組合為A2B1C3D1，即原料粒度50目、料液比1∶10、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間60 min。理論最優(yōu)組合和試驗(yàn)最優(yōu)組合在料液比上存在一定差異，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，將試驗(yàn)最優(yōu)組合和理論最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，對(duì)精油得率進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

由表3可知，A2B2C3D1（試驗(yàn)最優(yōu)組合）條件下精油得率高于A2B1C3D1（理論最優(yōu)組合），花椒精油最佳工藝為A2B2C3D1，即原料粒度50目、料液比1∶15、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間60 min。

2.4 花椒精油GC-MS組分分析

由表4和圖5可知，提取的花椒精油中共鑒定出86種物質(zhì)，花椒精油的主要成分為檸檬烯（18.267%）、4-萜烯醇（10.625%）、月桂烯（10.009%）、α-松油醇（8.199%）、乙酸松油酯（6.499%）、3-莰烯（6.512%）等。

2.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.5.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

花椒精油對(duì)DPPH自由基的清除能力見圖6。

由圖6可知，DPPH自由基清除率隨著花椒精油和VC質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，兩者的抗氧化能力有一定差異。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，花椒精油的DPPH自由基清除率達(dá)72.5%，表明花椒精油對(duì)DPPH自由基有一定清除能力，有較好的抗氧化活性[19]。

2.5.2 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

花椒精油對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力見圖7。

由圖7可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，花椒精油和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力都隨之增加，提取的花椒精油對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除效果，且與濃度呈正相關(guān)[20]。

3 結(jié)論

通過對(duì)花椒精油進(jìn)行提取工藝優(yōu)化、組分分析及抗氧化活性分析，結(jié)果表明，在原料粒度50目、料液比1∶15、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間60 min的條件下，提取的花椒精油得率最高，達(dá)2.61%；通過GC-MS分析，花椒精油中主要成分有檸檬烯（18.267%）、4-萜烯醇（10.625%）、月桂烯（10.009%）、α-松油醇（8.199%）、乙酸松油酯（6.499%）、3-莰烯（6.512%）等；通過DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花椒精油與VC的自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而上升，花椒精油具有較好的抗氧化活性。

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