L-酪氨酸連續(xù)發(fā)酵工藝研究

王銳麒　劉韙瑋　趙春光　徐慶陽(yáng)

摘要：當(dāng)前工業(yè)上用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的工藝中，基本都是前期向發(fā)酵罐內(nèi)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，中后期再流加各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，雖然整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中減少了取料和放料的操作，保證發(fā)酵中物料不被浪費(fèi)，但是，隨著流加物質(zhì)的不斷增加，發(fā)酵液體系不斷擴(kuò)大，該過(guò)程在發(fā)酵后期需要不斷地人為調(diào)控發(fā)酵參數(shù)，而人為調(diào)控中，難以避免調(diào)控參數(shù)波動(dòng)，并最終影響發(fā)酵結(jié)果。因此，實(shí)驗(yàn)采用高效連續(xù)發(fā)酵，該工藝可以大大提高菌體活力，并且有效延長(zhǎng)產(chǎn)酸高峰期，為了優(yōu)化L-酪氨酸的高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝，通過(guò)對(duì)大腸桿菌TYR-05發(fā)酵培養(yǎng)，考察了L-酪氨酸發(fā)酵過(guò)程并且分析了菌體量、產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸效率、糖酸轉(zhuǎn)化率的情況，確定L-酪氨酸高密度連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中接種量、糖速率、糖耗量、底糖濃度等關(guān)鍵條件，以達(dá)到高密度連續(xù)發(fā)酵工藝控制條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在5 L發(fā)酵罐中，選擇30%的種子接種量，發(fā)酵起始時(shí)，底物氯化膽堿濃度為1 g/L并每4 h向罐內(nèi)流加0.2 g/L的氯化膽堿，發(fā)酵至12 h時(shí)，底糖耗盡，開(kāi)始以12 g/（L·h）的補(bǔ)糖速率向罐內(nèi)提供葡萄糖，并在此時(shí)開(kāi)始放液，放液速率為0.13 L/h，使得裝液量恒定在20%左右，發(fā)酵25 h時(shí)開(kāi)始流加復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，發(fā)酵35 h時(shí)最高菌體OD600達(dá)到65，產(chǎn)酸量為55.8 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為25.4%，為L(zhǎng)-酪氨酸連續(xù)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：L-酪氨酸；連續(xù)發(fā)酵工藝；大腸桿菌；糖酸轉(zhuǎn)化率；補(bǔ)糖速率

中圖分類號(hào)：TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2024）01-0107-06

Study on Continuous Fermentation Technology of L-Tyrosine

WANG Rui-qiLIU Wei-weiZHAO Chun-guangXU Qing-yang1，3，4*

Abstract：? In the current industrial process of producing L-tyrosine by microbial fermentation method， the basic culture medium is generally added into the fermentation tank in the early stage， and then various nutrients are fed in the middle and later stages. Although in the entire fermentation process， the operations of taking and releasing materials are reduced， ensuring that materials are not wasted during the fermentation， with the continuous increase of fed-in materials， the fermentation liquid system continues to expand. The fermentation parameters need to be continuously regulated and controlled artificially in the later stage of fermentation.However， it is difficult to avoid the fluctuation of the regulation parameters in the artificial regulation and control， and eventually affecting the fermentation results. Therefore， efficient continuous fermentation is adopted in this experiment， which can greatly improve the cell vitality and effectively prolong the peak period of acid production. In order to optimize the high-density continuous fermentation production process of L-tyrosine， the fermentation process of L-tyrosine is investigated through the fermentation culture of E. coli TYR-05， and the biomass， acid productionamount， acid production efficiency and sugar-acid conversion rate are analyzed. Key conditions such as inoculation amount， sugar rate， sugar consumption amount and base sugar concentration are determined during the high-density continuous fermentation process of L-tyrosine， in order to achieve the optimization of the control conditions for the high-density continuous fermentation process. The experimental results show that in a 5 L fermentation tank， 30% seed inoculation amount is selected. At the beginning of fermentation， the substrate choline chloride concentration is 1 g/L， and 0.2 g/L choline chloride is fed into the tank every 4 h. After 12 h of fermentation， the base sugar is depleted， and glucose is supplied into the tank at a sugar supplement rate of 12 g/（L·h）. At this time， the liquid is released at a rate of 0.13 L/h to make the liquid volume constant at about 20%. After 25 h of fermentation， compound nutrient liquid is fed in. After 35 h of fermentation， the highest cell OD600 reaches 65， the acid production amount is 55.8 g/L， and the sugar-acid conversion rate is 25.4%， which has provided important references for the industrial production of L-tyrosine continuous fermentation.

Key words： L-tyrosine; continuous fermentation process; Escherichia coli; sugar-acid conversion rate; sugar supplement rate

L-酪氨酸是一種芳香族氨基酸，在人體中起著重要作用[1]，其在食品、飼料、醫(yī)藥和化工行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。酪氨酸在調(diào)節(jié)情緒、刺激神經(jīng)系統(tǒng)的同時(shí)，還可以加速新陳代謝、緩解疲勞[2]。因此，人體需要其產(chǎn)生許多關(guān)鍵的物質(zhì)，以便于幫助調(diào)節(jié)食欲和人體對(duì)壓力的反應(yīng)。酪氨酸也是重要的食品添加劑之一，已在乳類、肉類、飼料等食品方面得到廣泛的應(yīng)用[3]。

L-酪氨酸的生產(chǎn)方法目前有4種，分別是蛋白質(zhì)水解物提取法、化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法[4]。蛋白質(zhì)水解物提取法是比較傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法，該方法在工業(yè)中存在原料成本高、工藝復(fù)雜、周期漫長(zhǎng)、收取率低等問(wèn)題，并且對(duì)環(huán)境污染較大[5]?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)酪氨酸主要得到的是DL-酪氨酸，從DL-酪氨酸到L-酪氨酸需要進(jìn)一步拆分，工藝繁瑣、能耗大，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。酶法生產(chǎn)酪氨酸雖然方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫和、收取率高，但是其生產(chǎn)中酶的活性不易控制，會(huì)受到前體物質(zhì)的抑制[6]。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酪氨酸是目前主要的生產(chǎn)方法，該方法原材料廉價(jià)，在合適的發(fā)酵條件下，菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵可直接獲得L-酪氨酸，且發(fā)酵成本低，原料易獲得，反應(yīng)所需能耗小，對(duì)環(huán)境沒(méi)有很大的污染[7]。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸根據(jù)生產(chǎn)菌種、原料、裝置特征、技術(shù)可行性等方面可以選擇不同的發(fā)酵方式[8]，常見(jiàn)的發(fā)酵方式有好氧/厭氧發(fā)酵、液體/固體發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵。本文根據(jù)L-酪氨酸的特性，選擇菌種的高效連續(xù)發(fā)酵，該方法菌種活力好、產(chǎn)酸效率高。

大腸桿菌因?yàn)樯L(zhǎng)速率快、易于培養(yǎng)且生產(chǎn)L-酪氨酸有優(yōu)勢(shì)，成為發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的主要微生物，是目前工業(yè)生產(chǎn)中理想的菌株之一[9]。雖然眾多科研人員開(kāi)展了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的研究，但發(fā)酵技術(shù)仍然不成熟。針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中生物量低、生產(chǎn)速率低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，本文通過(guò)對(duì)大腸桿菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸各參數(shù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，達(dá)到提高L-酪氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的目的，以期為L(zhǎng)-酪氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-酪氨酸生產(chǎn)菌：大腸桿菌TYR-05（PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ApheLA），天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L;酵母粉4 g/L；檸檬酸鹽2 g/L；（NH4）2SO4·7H2O 2.5 g/L；KH2PO4·3H2O 3 g/L；MgSO4·7H2O 2 g/L；FeSO4·7H2O 5 mg/L；MnSO4·7H2O 1 mg/L；VH 0.5 mg/L；VB混0.5 mg/L;微量元素混合液1 mL/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L；酵母粉4 g/L;（NH4）2SO4 3 g/L；KH2PO4·3H2O 3 g/L，檸檬酸鹽1.8 g/L;蛋氨酸1 g/L；苯丙氨酸0.8 g/L;FeSO4·7H2O 30 mg/L;MnSO4·H2O 10 mg/L;VH 1 mg/L；VB混0.5 mg/L；微量元素混合液1.5 mL/L。

1.3 主要儀器

Biotech-100KBS發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40ES生物傳感儀 濟(jì)南延和生物科技有限公司；BT-4電子天平 深圳博途電子科技有限公司；75UV分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；Olympus生物顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；氨基酸專用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，No.20200031） 大連依利特分析儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

從－80 ℃冰箱中取出菌株，在超凈臺(tái)中于酒精燈火焰旁用接種環(huán)取3環(huán)于試管斜面上，于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h。

1.4.2 一級(jí)種子培養(yǎng)

待菌種活化好后，在超凈臺(tái)中于酒精燈火焰旁用接種環(huán)取3環(huán)于茄形瓶斜面培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.4.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

待一級(jí)種子活化好后，用滅過(guò)菌的洗菌水在超凈臺(tái)清洗菌體，將洗好的菌液在發(fā)酵罐補(bǔ)料口于火焰旁倒入發(fā)酵罐中，控制罐內(nèi)發(fā)酵溫度為36 ℃，在pH 7.0環(huán)境下培養(yǎng)。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

當(dāng)菌體量OD600達(dá)到要求時(shí)，按相應(yīng)要求的接種量放液，同時(shí)加入發(fā)酵培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，加入底糖，流加調(diào)控氨水來(lái)調(diào)節(jié)pH，使pH維持在7.0～7.2，調(diào)節(jié)攪拌軸控制罐內(nèi)溶氧，調(diào)節(jié)通風(fēng)控制罐壓，使罐壓維持在0.0 發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵周期35 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入底糖，接種完后將發(fā)酵液體系定容到發(fā)酵罐體積的20%左右開(kāi)始發(fā)酵，當(dāng)罐內(nèi)殘?zhí)呛谋M或其含量為0.1 g/L時(shí)對(duì)其進(jìn)行流加補(bǔ)糖，控制流加速率，維持罐內(nèi)殘?zhí)菨舛?，使其濃度?.1 g/L，同時(shí)控制泵出速率與補(bǔ)糖速率的動(dòng)態(tài)平衡，使得泵出體積與補(bǔ)料體積一樣，以保持罐內(nèi)體積穩(wěn)定。連續(xù)發(fā)酵工藝布局圖見(jiàn)圖1。

1.5.1 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵接種量的確定

為了確定連續(xù)發(fā)酵最適生物接種量，對(duì)不同接種量下菌體量OD600的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)酸量的關(guān)系進(jìn)行測(cè)定。分別采用接種量15%、20%、25%、30%進(jìn)行發(fā)酵，分析不同接種比例對(duì)菌體OD和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響，并確定最適接種量。

1.5.2 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵底糖濃度和補(bǔ)糖濃度的確定

為了確定連續(xù)發(fā)酵最適發(fā)酵底糖濃度和補(bǔ)糖濃度，在最適接種量的條件下發(fā)酵，每4 h記錄每升發(fā)酵液所消耗糖量，經(jīng)計(jì)算得出最適底糖濃度，依據(jù)平均耗糖速率計(jì)算得出補(bǔ)糖濃度。

1.5.3 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵底物氯化膽堿濃度和添加時(shí)間的確定

為了確定高效連續(xù)發(fā)酵底物中氯化膽堿的最適添加量，分別向底物中添加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的氯化膽堿，于三角瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并分析不同濃度對(duì)產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響。為了確定流加氯化膽堿的添加濃度和添加時(shí)間，選擇在0， 8，12，16，20 h分別流加0，0.1，0.2，0.3，0. 0.5 g/L的氯化膽堿，確定最佳的流加工藝。

1.5.4 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵流加補(bǔ)料的確定

為了確定連續(xù)高效發(fā)酵流加補(bǔ)料的效果，在初步確定好連續(xù)發(fā)酵L-酪氨酸的各個(gè)成分濃度后，在發(fā)酵菌體衰退期加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，分析流加營(yíng)養(yǎng)液后菌體OD、耗糖量、產(chǎn)量的變化，確定流加復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)連續(xù)高效發(fā)酵的時(shí)間。

1.6 發(fā)酵檢測(cè)方法

1.6.1 發(fā)酵過(guò)程中pH的測(cè)定

發(fā)酵罐內(nèi)的pH用罐自帶的pH電極測(cè)定，精密pH試紙輔助測(cè)定。

1.6.2 發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)堑臏y(cè)定

罐中取樣，用離心機(jī)離心留上清液，將上清液稀釋100倍，用SBA-40ES生物傳感儀測(cè)定殘?zhí)呛俊?/p>

1.6.3 發(fā)酵過(guò)程中菌體量的測(cè)定

每2 h從發(fā)酵罐中取樣，吸取原樣稀釋相應(yīng)倍數(shù)，用75UV分光光度計(jì)測(cè)定菌體量，菌體量可用吸光度OD600表示，其計(jì)算方式為菌體量=OD600×稀釋倍數(shù)。

1.6.4 發(fā)酵過(guò)程中L-酪氨酸的測(cè)定

發(fā)酵開(kāi)始，每2 h取樣，用離心機(jī)離心留上清液，取上清液稀釋100，200，300等相應(yīng)倍數(shù)，再用SBA-40ES生物傳感分析儀測(cè)定酪氨酸產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵接種量的確定

由于不同接種量會(huì)影響菌體生長(zhǎng)情況，進(jìn)而很大程度影響L-酪氨酸的產(chǎn)量，且接種量與發(fā)酵前期生長(zhǎng)速度和開(kāi)始產(chǎn)酸高峰期的時(shí)間息息相關(guān)[10]，因此，本實(shí)驗(yàn)為了確定最適接種量，設(shè)計(jì)不同接種量進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定在不同接種量下菌體量OD600和產(chǎn)酸的情況。實(shí)驗(yàn)組分別為A（15%）、B（20%）、C（25%）、D（30%）。

由圖2可知，在接種量為30%時(shí)，菌體生長(zhǎng)快，產(chǎn)酸速率高，最大OD600為35，較其他實(shí)驗(yàn)組分別提高了18.1%、33.2%、41.3%，最大產(chǎn)酸量為42.4 g/L，較其他實(shí)驗(yàn)組分別提高了13.8%、19.6%、32.2%。在發(fā)酵25 h后，所有實(shí)驗(yàn)組菌體量都有所下降，產(chǎn)酸速率也變得緩慢，在最適接種量的前提下，發(fā)酵后期對(duì)其他方式進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到增強(qiáng)菌體活力、提高產(chǎn)物生成速率的目的[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)為了在發(fā)酵前期獲得較高的菌體量和菌體活力，選擇接種量為30%的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵工藝的研究。

2.2 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵底糖濃度和補(bǔ)糖濃度的確定

在確定好合適的接種量的條件下，選擇合適的底糖濃度和補(bǔ)糖濃度以及補(bǔ)糖時(shí)間，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)酸速率有著重要影響[12]。底糖濃度決定著發(fā)酵在哪個(gè)階段才能開(kāi)始補(bǔ)糖，由于本實(shí)驗(yàn)要求在補(bǔ)料的同時(shí)放出相同體積的發(fā)酵液以維持罐內(nèi)發(fā)酵體系的穩(wěn)定，并且使罐內(nèi)殘?zhí)蔷S持在一定的濃度水平，因此，需選擇一個(gè)最適補(bǔ)糖速率，才能使得罐內(nèi)殘?zhí)翘幱诜€(wěn)定水平。在接種量30%的水平上研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到12 h時(shí)，L-酪氨酸合成速率開(kāi)始緩慢下降，因此選擇在12 h進(jìn)行補(bǔ)料并且開(kāi)始放液。

由圖3可知，每2 h測(cè)定每升發(fā)酵液的耗糖量，經(jīng)計(jì)算得知，發(fā)酵12 h時(shí)總消耗糖量為24 g/L，因此罐內(nèi)底糖濃度為24 g/L。在發(fā)酵8～12 h的時(shí)間段，發(fā)酵平均耗糖速率為12 g/（L·h），因此，想要維持L-酪氨酸的高產(chǎn)酸率，必須向罐內(nèi)提供的底糖濃度為24 g/L，補(bǔ)糖速率至少維持在12 g/L。在5 L發(fā)酵罐中，由于罐內(nèi)發(fā)酵體系體積為罐的30%，即1.5 L的發(fā)酵液，若要使發(fā)酵體系維持在恒定的水平，防止發(fā)酵液體系變大對(duì)產(chǎn)量的影響，經(jīng)計(jì)算，需保持0.13 L/h的發(fā)酵液放液速率。

2.3 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵底物氯化膽堿濃度和添加時(shí)間的確定

在L-酪氨酸的發(fā)酵過(guò)程中，生長(zhǎng)因子作為必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其在微生物體內(nèi)的主要作用為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)酶活及產(chǎn)物代謝等。而在L-酪氨酸連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子之一為氯化膽堿，氯化膽堿可以促進(jìn)細(xì)胞膜的合成。蛋氨酸、葉酸等可以在細(xì)胞內(nèi)提供不穩(wěn)定的甲基，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)代謝，氯化膽堿也可以提供不穩(wěn)定的甲基。微生物利用維生素B12和葉酸作為輔酶，通過(guò)絲氨酸和蛋氨酸合成膽堿，故在底物中流加氯化膽堿可以提供活性甲基，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，從而提高L-酪氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

為了明確底物氯化膽堿的最適添加量，分別向底物中添加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的氯化膽堿，于三角瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，期間用氨水調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，發(fā)酵35 h，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)?shù)孜镏新然憠A添加量不同時(shí)，其對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的促進(jìn)作用差別較大。當(dāng)?shù)孜镏新然憠A濃度為0～2.5 g/L時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量隨著底物添加量的增加而提高。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.0 g/L時(shí)，L-酪氨酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到15 g/L。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)1.0 g/L時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值，隨著氯化膽堿濃度的增加，L-酪氨酸的產(chǎn)量不再增加，但糖酸轉(zhuǎn)化率降低，可能是搖瓶?jī)?nèi)溶氧不夠?qū)е碌?，從而影響了L-酪氨酸的產(chǎn)量。因而，從節(jié)省成本、綜合產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率等方面考慮，發(fā)酵底物中氯化膽堿最適添加濃度為1.0 g/L。

由于在底物培養(yǎng)基中不同添加量的氯化膽堿對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的促進(jìn)作用有著明顯的差異，因此考察了不同發(fā)酵時(shí)間流加氯化膽堿對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響。在搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)10%氨水調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，發(fā)酵35 h時(shí)結(jié)束。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，選擇發(fā)酵前期和中期進(jìn)行流加，故本實(shí)驗(yàn)選擇在0， 8，12，16，20 h分別流加0，0.1，0.2，0.3，0. 0.5 g/L的氯化膽堿，發(fā)酵過(guò)程中L-酪氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在不同的發(fā)酵時(shí)間段，底物中流加氯化膽堿的量不同，對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的促進(jìn)作用有一定差異。在發(fā)酵過(guò)程中流加0.2 g/L的氯化膽堿，L-酪氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，隨著流加氯化膽堿濃度的增加，搖瓶?jī)?nèi)溶氧不足，產(chǎn)量保持不變。因而，選擇在發(fā)酵過(guò)程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿，效果最好。

2.4 L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵流加補(bǔ)料的確定

前期實(shí)驗(yàn)中，初步得出高效連續(xù)發(fā)酵工藝發(fā)酵所需基本條件：發(fā)酵底糖濃度24 g/L，發(fā)酵12 h后開(kāi)始補(bǔ)加糖，其補(bǔ)加速率至少維持在12 g/（L·h），底物氯化膽堿添加量為1 g/L，發(fā)酵過(guò)程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿，發(fā)酵放液速率為0.13 L/h左右。根據(jù)上述參數(shù)進(jìn)行控制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。在12 h后開(kāi)始補(bǔ)糖，菌體的活力依舊很高，菌體OD值小幅度增長(zhǎng)，罐內(nèi)體積維持在穩(wěn)定水平，但發(fā)酵25 h后，菌體活力開(kāi)始下降，產(chǎn)酸和糖耗量開(kāi)始降低，發(fā)酵28 h時(shí)，測(cè)得罐內(nèi)L-酪氨酸的濃度為48.1 g/L，說(shuō)明菌體活力明顯下降。

由圖6可知，通過(guò)連續(xù)發(fā)酵，可使L-酪氨酸產(chǎn)酸高峰期從16 h延長(zhǎng)至25 h，如果在發(fā)酵25 h后添加培養(yǎng)基相似成分的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，可有效延長(zhǎng)菌體的活力以及產(chǎn)酸高峰期[13-14]。

由圖7可知，在補(bǔ)加復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液發(fā)酵25 h后，菌體量、產(chǎn)酸速率依舊維持在較高水平，直到發(fā)酵35 h后，菌體OD值和產(chǎn)酸量開(kāi)始緩慢下降，發(fā)酵35 h時(shí)測(cè)得L-酪氨酸產(chǎn)量降至52.4 g/L，由此停止發(fā)酵。可見(jiàn)在高效連續(xù)發(fā)酵工藝中，發(fā)酵后期補(bǔ)與加培養(yǎng)基相似的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，有利于緩解菌體衰退，維持菌體生長(zhǎng)代謝的活力[15-16]。

2.5 高效連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝中L-酪氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率

本實(shí)驗(yàn)中，核算各個(gè)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。發(fā)酵35 h時(shí)，連續(xù)發(fā)酵的L-酪氨酸產(chǎn)量約為55.8 g/L，累計(jì)耗糖量為990 g，糖酸轉(zhuǎn)化率約為25.5%，相對(duì)于普通發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率提高了28.1%。單批次發(fā)酵L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到247.5 g，相較于普通發(fā)酵產(chǎn)量126.4 g，總產(chǎn)量提高了49.1%；整個(gè)發(fā)酵工藝中，L-酪氨酸的平均產(chǎn)酸量為7.1 g/h，相較于普通發(fā)酵的3.6 g/h，產(chǎn)酸量提高了約49.2%。由此可知，該工藝中，菌體活力好、生長(zhǎng)旺盛、耗糖快、產(chǎn)酸多，因而導(dǎo)致糖酸轉(zhuǎn)化率高于一般發(fā)酵法[17-18]。因此，高效連續(xù)發(fā)酵工藝可以有效地提高L-酪氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率[19]。

3 結(jié)論

L-酪氨酸是重要的食品添加劑，具有治療抑郁癥、舒緩壓力等功能，因此受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，微生物連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸具有廣闊的研究前景。

在L-酪氨酸高效連續(xù)發(fā)酵工藝研究中，其產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率是發(fā)酵控制的基本指標(biāo)，本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最適接種量為30%，底糖濃度為12 g/L，補(bǔ)糖速率為12 g/（L·h），放料速率為0.13 L/h，底物氯化膽堿添加量為1 g/L，并在發(fā)酵過(guò)程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿。實(shí)驗(yàn)表明，在高接種量的前提下，該發(fā)酵方法使得菌體能快速進(jìn)入產(chǎn)酸期，由于在補(bǔ)加糖和營(yíng)養(yǎng)物的同時(shí)以相同放料速率放出發(fā)酵液，使得罐內(nèi)體系維持平衡，且菌體活力很好，使得產(chǎn)酸周期延長(zhǎng)至35 h，較普通發(fā)酵提高了30.3%，單批次發(fā)酵L-酪氨酸產(chǎn)量為247.5 g，較普通發(fā)酵提高了49.1%，糖酸轉(zhuǎn)率提高了49.2%，可見(jiàn)連續(xù)發(fā)酵能夠有效提高L-酪氨酸發(fā)酵的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率，具有很大的工業(yè)生產(chǎn)研究潛力。

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收稿日期：2023-08-16

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021BDE92007）;山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021ZDSYS10）

作者簡(jiǎn)介：王銳麒（1998－），男，碩士研究生，研究方向：代謝工程及發(fā)酵過(guò)程控制。

*通信作者：徐慶陽(yáng)（1980－），男，副研究員，博士，研究方向：代謝工程及發(fā)酵過(guò)程控制。