牟 燕,賴茂佳,易宇文,范文教*
(1.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院,四川 成都 610100;2.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610100)
牦牛系川西及藏區(qū)主要特產(chǎn)之一,以天然優(yōu)質(zhì)牧草、無(wú)公害野草為主要食物,被譽(yù)為“高原之舟”[1];牦牛肉以其“高蛋白、低脂肪、無(wú)污染”被廣泛認(rèn)為是綠色、健康、優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源[2]。其加工制品川味牦牛肉香腸是四川乃至西南地區(qū)的特色傳統(tǒng)肉制品,常使用辣椒、花椒、胡椒等作為輔料,味重麻辣[3],廣受消費(fèi)者青睞。牦牛肉自然發(fā)酵香腸主要是通過(guò)環(huán)境和原料肉中本身具有的微生物作用,這些微生物可能含有致病菌以及導(dǎo)致氨基酸脫羧形成生物胺,存在食用安全潛在風(fēng)險(xiǎn),限制了川味牦牛肉香腸的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。近年來(lái)隨著消費(fèi)者對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)安全的高度重視,許多性能優(yōu)良、可以提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量、感官品質(zhì)以及產(chǎn)品安全性的微生物發(fā)酵劑已成為發(fā)酵香腸研究的熱點(diǎn)[4]。
微生物的種類和作用是發(fā)酵香腸品質(zhì)特征形成的重要因素之一,在肉制品發(fā)酵過(guò)程中,微生物參與發(fā)揮水解蛋白質(zhì)和分解脂質(zhì)的作用,不僅可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,還可以提高產(chǎn)品的安全性[5]。功能性發(fā)酵劑是指能在香腸中發(fā)揮理想代謝活性的微生物制劑,其研究主要集中在乳酸菌、凝固酶陰性的葡萄球菌、酵母菌及霉菌等方面[6-7]。研究表明,人工接種乳酸菌發(fā)酵劑能夠加速牦牛肉香腸的產(chǎn)酸速率,抑制一些不耐酸有害微生物的生長(zhǎng),改善香腸理化特性,同時(shí)促進(jìn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成,更好提升香腸的口感,延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期[8]。李木子等[9]研究表明,彎曲乳桿菌在液體培養(yǎng)基中具有降低亞硝胺的能力;翟鈺佳[10]研究篩選出了不產(chǎn)生物胺且具有較強(qiáng)胺氧化酶活性的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。目前,發(fā)酵牦牛肉香腸仍存在亞硝酸鹽含量超標(biāo)、品質(zhì)不穩(wěn)定問(wèn)題,因此,探討有助于川味牦牛肉香腸保持風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)健康的微生物發(fā)酵劑是一項(xiàng)很有經(jīng)濟(jì)意義的工作。
本研究以具有四川傳統(tǒng)特色的川味牦牛肉香腸為研究對(duì)象,分別接種彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)(LC)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)(LP)以及其復(fù)配菌(1∶1)(FP)制作川味牦牛肉香腸,以自然發(fā)酵(CK)為對(duì)照組,在3 ℃下貯藏7 d后,測(cè)定其理化及微生物指標(biāo)、顏色參數(shù)、質(zhì)構(gòu)、揮發(fā)性香氣及感官品質(zhì),以期探究微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉發(fā)酵香腸品質(zhì)指標(biāo)的影響,為其發(fā)酵工藝的優(yōu)化和產(chǎn)品品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。
新鮮牦牛后腿肉、豬肥膘、食鹽、辣椒粉、料酒、花椒粉等:市售;彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)Y15、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CM25:烹飪科學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;菌落總數(shù)測(cè)試片:廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司;丙二醛檢測(cè)試劑盒:江蘇艾迪生生物科技有限公司;硼砂、鹽酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀(均為分析純):成都金山化學(xué)試劑有限公司。
FOX 4000電子鼻:法國(guó)Alpha MOS公司;TMS-PRO型食品物性分析儀:美國(guó)FTC公司;UV BlueStar A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京萊伯泰科儀器有限公司;DC-P3新型全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì):北京興光測(cè)色儀器有限公司;S470 pH計(jì):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.3.1 川味牦牛肉發(fā)酵香腸的制作工藝流程及操作要點(diǎn)
操作要點(diǎn):
預(yù)處理:將牦牛肉清洗除去筋膜、筋腱,切成大小一致的肉塊(1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm),瀝干表面的水分。
腌制:將牦牛肉與豬肥膘按照質(zhì)量比8∶2混合,添加2%食鹽、3%辣椒粉、1%花椒粉、0.1%五香粉、0.1%姜粉、1%蔗糖、0.1%味精、2%料酒(均以肉質(zhì)量計(jì)),充分混勻后放置于(3±1)℃的冰箱腌制24 h。
活化、接種:準(zhǔn)確稱取10.0 g脫脂奶粉和1.50 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中,加入2.0 g菌粉攪拌,在(25±1)℃活化2 h;對(duì)腌制完成的原料進(jìn)行接種,接種量為107CFU/g。實(shí)驗(yàn)分為4組,未添加菌自然發(fā)酵對(duì)照組(CK)、添加彎曲乳桿菌組(LC)、添加植物乳桿菌組(LP)、添加彎曲乳桿菌組與植物乳桿菌組復(fù)配菌組(質(zhì)量比1∶1)(FP)。
灌腸:將肉餡灌于豬小腸衣內(nèi),使每節(jié)腸長(zhǎng)度在10 cm左右,用線繩結(jié)扎并用排氣針有規(guī)律的扎眼,排除腸體內(nèi)部的空氣。
發(fā)酵、干燥成熟:發(fā)酵溫度為(25±1)℃,相對(duì)濕度為80%,發(fā)酵5 d,然后將香腸移至陰涼通風(fēng)的環(huán)境下(15~20 ℃)繼續(xù)風(fēng)干發(fā)酵5 d。
成品:真空包裝后的成品置于3 ℃下保藏7 d后即得川味牦牛肉發(fā)酵香腸成品。
1.3.2 分析檢測(cè)
pH值的測(cè)定:參照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》;亞硝酸鹽含量的測(cè)定:參照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中分光光度法;丙二醛的測(cè)定:參照試劑盒說(shuō)明操作,結(jié)果表示為每毫克肉樣所含丙二醛含量(nmol/mg);菌落總數(shù)的測(cè)定:參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。
1.3.3 顏色參數(shù)的測(cè)定
將香腸切成2 cm厚的切片,通過(guò)白板進(jìn)行儀器校準(zhǔn),使用校正后的色差儀測(cè)定其L*值、a*值和b*值。
1.3.4 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定
參考趙改名等[11]的方法略作修改。將川味牦牛肉發(fā)酵香腸去除腸衣后切成3 cm厚的柱狀,使用P50探頭對(duì)香腸質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)。測(cè)定指標(biāo)為硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠粘性、咀嚼性。設(shè)定測(cè)定參數(shù)為:初始力5 N,壓縮比50%,測(cè)試速度:60 mm/min,深度20 mm,最小感應(yīng)力0.38 N,停頓5 s。
1.3.5 揮發(fā)性香氣的測(cè)定
參照楊長(zhǎng)平等[12]的方法稍作修改,將川味牦牛肉香腸去除腸衣并充分剁碎,準(zhǔn)確稱量1.0 g均勻的肉糜于15 mL頂空瓶中,用硅膠隔墊密封,于室溫靜置30 min后采用頂空吸氣法進(jìn)行分析。參數(shù)為:間隔時(shí)間1 s,傳感器自動(dòng)清洗時(shí)間80 s,歸零時(shí)間10 s,進(jìn)樣準(zhǔn)備時(shí)間5 s,采樣測(cè)定時(shí)間100 s,進(jìn)樣流量300 mL/min。為確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性,選取較為平穩(wěn)的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。電子鼻傳感器性能特點(diǎn)見(jiàn)表1。
表1 電子鼻傳感器性能特點(diǎn)Table 1 Performance characteristics of electronic nose sensors
1.3.6 感官評(píng)價(jià)
參考李一鳴等[13]的方法稍作修改,邀請(qǐng)10名(男女各5名)經(jīng)感官評(píng)分學(xué)習(xí)的專業(yè)人員組成評(píng)定小組。分別從外觀、滋味、質(zhì)地、氣味4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià),滿分80分,具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。
表2 川味牦牛肉發(fā)酵香腸感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented sausages of Sichuan yak sausage
1.3.7 數(shù)據(jù)處理
對(duì)以上實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)使用Excel 2019統(tǒng)計(jì)處理,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”;應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著;應(yīng)用Origin 2021繪圖分析。
在川味牦牛肉香腸發(fā)酵過(guò)程中,pH值的高低會(huì)影響發(fā)酵肉的顏色、嫩度、感官以及風(fēng)味。乳酸菌作為發(fā)酵劑在適宜溫度和濕度條件通過(guò)代謝作用會(huì)分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)[14],使pH值降低。由圖1可知,四組香腸的pH值均在適宜范圍內(nèi)(5.117~5.345),pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)香腸的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響[15]。CK組pH值顯著高于接種發(fā)酵劑的處理組(P<0.05);LC、LP組pH值接近,而復(fù)配菌組(FP組)pH值最低,為5.117。兩種菌在發(fā)酵階段適宜溫、濕度條件下具有快速產(chǎn)酸的能力,使pH值保持在較低范圍內(nèi),有效防止因雜菌過(guò)度增殖造成的產(chǎn)品腐敗變質(zhì)現(xiàn)象,延長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)品的貨架期[17],這與馮美琴等[16]的研究結(jié)果一致。
圖1 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸pH值的影響Fig.1 Effect of microbial starter culture on pH value of Sichuan yak sausage
亞硝酸鹽是發(fā)酵香腸中常用的發(fā)色劑,在肉制品加工中占據(jù)“統(tǒng)治”地位,但其易生成具有致癌性的亞硝基化合物危害人體健康[18]。
由圖2可知,4組川味牦牛肉香腸的亞硝酸鹽含量均不超過(guò)食品中亞硝酸鹽殘留量的安全標(biāo)準(zhǔn)限值(30 mg/kg)。CK組亞硝酸鹽殘留量為5.55 mg/kg,顯著高于其他3組(P<0.05),LC組、LP組、FP組的亞硝酸鹽殘留量分別為3.86mg/kg、3.80 mg/kg、2.50 mg/kg,這可能是因?yàn)镃K組沒(méi)有接種發(fā)酵劑,乳酸菌數(shù)量相對(duì)較少,對(duì)形成亞硝酸鹽的抑制能力較弱。而FP組接種了彎曲乳桿菌和植物乳桿菌,產(chǎn)酸較多,pH值較低,pH值同亞硝酸鹽的降低值具有相關(guān)性,pH值越小,發(fā)酵后亞硝酸鹽降低值越大[19],因此FP組亞硝酸鹽殘留量處于最低水平,該結(jié)果與王德寶等[20]報(bào)道的接種清酒乳桿菌、木糖葡萄球菌及肉葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵劑香腸的結(jié)果相似。上述結(jié)果表明,微生物發(fā)酵劑有助于抑制亞硝酸鹽的形成[21],提高川味牦牛肉發(fā)酵香腸食用的安全性,且彎曲乳桿菌和植物乳桿菌兩種菌復(fù)配使用效果更理想。
圖2 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of microbial starter culture on nitrite content of Sichuan yak sausage
丙二醛是脂肪的氧化終產(chǎn)物之一,它與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)在一定條件下發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì),因此TBA值是評(píng)價(jià)肉制品脂肪氧化程度最常用的指標(biāo)之一,丙二醛含量越高,脂肪氧化程度越深[22]。由圖3可知,CK組脂肪氧化程度始終顯著高于其他3組(P<0.05),丙二醛含量高達(dá)1.22 nmol/mg,是復(fù)配菌組含量(0.52 nmol/mg)的2.35倍,LC組、LP組丙二醛含量分別為0.79 nmol/mg、0.74 nmol/mg。通力嘎[23]利用植物乳桿菌與木糖葡萄球菌混合制作發(fā)酵香腸,混合菌種組TBA值顯著下降,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同??赡苁怯捎谌樗峋谌忸惏l(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶分解過(guò)氧化物,從而抑制脂肪氧化酸敗[24],有利于防止發(fā)酵肉制品脂肪因過(guò)度氧化產(chǎn)生酸敗味和哈喇味等不愉快氣味。該結(jié)果說(shuō)明彎曲乳桿菌和植物乳桿菌的添加降低了丙二醛的生成,減緩了香腸的脂肪氧化程度,且兩種發(fā)酵劑混合使用效果更佳。
圖3 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of microbial starter culture on malondialdehyde content of Sichuan yak sausage
發(fā)酵香腸的顏色與其品質(zhì)密切相關(guān)[25]。L*值代表香腸肉樣的亮度,該值越高說(shuō)明產(chǎn)品光澤度越好;a*值代表紅度值,b*值代表黃度值,a*值越大說(shuō)明產(chǎn)品色澤越好,新鮮度越高,而b*值相反[26]。4組川味牦牛肉香腸的顏色參數(shù)見(jiàn)表3。由表3可知,F(xiàn)P組L*值、a*值均最大,分別為58.52和19.93,LP組次之,這與HWANG K E等[27]的研究結(jié)果類似。各處理組的顏色參數(shù)與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05),LC組和LP組的b*值差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于CK組(P<0.05)。說(shuō)明在川味牦牛肉香腸中添加微生物發(fā)酵劑能夠?qū)ο隳c的顏色產(chǎn)生積極影響,延緩色澤的衰退提高穩(wěn)定性,其中兩種發(fā)酵劑的復(fù)配使用對(duì)香腸的色澤提升作用最明顯。
表3 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸顏色參數(shù)的影響Table 3 Effect of microbial starter culture on color parameter of Sichuan yak sausage
品質(zhì)上乘的牦牛肉香腸應(yīng)具有硬度適宜,組織結(jié)構(gòu)緊致,切片富有彈性等優(yōu)良品質(zhì)[28]。發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸質(zhì)構(gòu)特性的影響見(jiàn)表4。由表4可知,各組牦牛肉香腸質(zhì)構(gòu)特性差異顯著(P<0.05),F(xiàn)P組的硬度值、內(nèi)聚性、彈性、膠粘性、咀嚼性均高于其他組。有文獻(xiàn)報(bào)道,乳酸菌的蛋白分解作用會(huì)導(dǎo)致巰基基團(tuán)減少,使產(chǎn)品的硬度增加,腸體更加緊密[29]。內(nèi)聚性是香腸切片性的重要特征,添加發(fā)酵劑對(duì)牦牛肉香腸的內(nèi)聚性提高效果顯著。LC組、LP組的內(nèi)聚性、彈性、膠粘性無(wú)顯著差異(P>0.05),而香腸的咀嚼性與硬度差異顯著(P<0.05),CK組咀嚼性僅為101.087 mJ,而FP組高達(dá)299.287 mJ,香腸更有嚼勁。可見(jiàn)發(fā)酵劑對(duì)改善牦牛肉香腸的質(zhì)構(gòu)具有重要作用,且FP組效果最好。
表4 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 4 Effect of microbial starter culture on texture characteristics of Sichuan yak sausage
川味牦牛肉香腸電子鼻雷分析達(dá)圖及主成分分析見(jiàn)圖4。由圖4a可知,18根傳感器對(duì)樣品揮發(fā)性成分的響應(yīng)不同。在LY2/LG~LY2/gCT傳感器上,4種川味牦牛肉香腸的風(fēng)味輪廓相似;其差異主要體現(xiàn)在T30/1~TA/2這12根傳感器上,CK組的響應(yīng)值明顯低于其他3種發(fā)酵香腸,4種香腸對(duì)相應(yīng)于氨、醇的P30/1傳感器響應(yīng)值最大,其次是對(duì)應(yīng)乙醛、胺類化合物的PA/2傳感器。因此,醇、胺類含量的差異可能是影響4組發(fā)酵香腸揮發(fā)性香氣差異的主要物質(zhì),添加微生物發(fā)酵劑能使川味牦牛肉香腸產(chǎn)生更多的乙醇。
圖4 川味牦牛肉香腸電子鼻分析雷達(dá)圖(a)及主成分分析(b)Fig.4 Sichuan yak sausage electronic nose analysis radar map (a)and principal component analysis (b)
由圖4b可知,第一主成分(principal components1,PC1)方差貢獻(xiàn)率為97.0%,第二主成分(PC2)方差貢獻(xiàn)率為2.5%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率99.5%,說(shuō)明電子鼻對(duì)香腸香氣化合物的信息提取較為完整。從4種香腸分布距離來(lái)看,CK組單獨(dú)集中分布在第三象限,與其他3組香腸組間距離較大,說(shuō)明自然發(fā)酵的香腸與加入發(fā)酵劑的香腸香氣差異顯著,且在PC1、PC2方向上差異均明顯。LC組和FP組均分布在第二象限,說(shuō)明添加彎曲乳桿菌和復(fù)配菌組香腸的揮發(fā)性香氣成分比較接近。因此,添加微生物發(fā)酵劑會(huì)使川味牦牛肉香腸的香氣成分差異變大。
發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸菌落總數(shù)的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,各組川味牦牛肉香腸菌落總數(shù)從低到高排序?yàn)镃K組<LC組<LP組<FP組,LC組、LP組菌落總數(shù)分別為8.00 lg(CFU/g)、9.00 lg(CFU/g),差異不顯著(P>0.05)。FP組菌落總數(shù)為10.17 lg CFU/g,顯著高于CK組(6.50 lg(CFU/g))(P<0.05)。在川味牦牛肉香腸的發(fā)酵過(guò)程中,原料肉自身攜帶有優(yōu)勢(shì)微生物,而發(fā)酵劑的添加使產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)勢(shì)菌快速生長(zhǎng)繁殖,數(shù)量增加。復(fù)配菌組接種了彎曲和植物兩種乳桿菌,效果更明顯,可能與接種微生物的種類有關(guān),段艷等[30]的研究表明,乳酸菌是發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢(shì)菌且植物乳桿菌的添加使其優(yōu)勢(shì)更加明顯。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸使pH降低,可以抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)來(lái)防止異味和酸敗的形成,改善川味牦牛肉香腸制品的風(fēng)味。
圖5 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effect of microbial starter culture on the total number of colonies of Sichuan yak sausage
川味牦牛肉香腸各實(shí)驗(yàn)組的感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,添加了發(fā)酵劑的處理組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于CK組,其中,F(xiàn)P組川味牦牛肉香腸感官評(píng)分最高,為72.7分。LC組、LP組、FP組川味牦牛肉香腸在外觀、質(zhì)地以及氣味方面評(píng)分較高,但差異不顯著(P>0.05);從滋味來(lái)看,F(xiàn)P組評(píng)分與其他組有顯著差異(P<0.05),評(píng)分高達(dá)18.4分。表明微生物發(fā)酵劑的添加促進(jìn)了蛋白質(zhì)、脂肪分解生成風(fēng)味物質(zhì),提高川味牦牛肉香腸的滋氣味[31],同時(shí)改善產(chǎn)品的色澤,使產(chǎn)品更加符合消費(fèi)者的口感要求,提高其接受度。因此復(fù)配菌組發(fā)酵制得的川味牦牛肉香腸品質(zhì)更優(yōu)且更適合生產(chǎn)與推廣。
圖6 微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸感官品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of microbial starter culture on sensory quality of Sichuan yak sausage
該實(shí)驗(yàn)研究微生物發(fā)酵劑對(duì)川味牦牛肉香腸品質(zhì)指標(biāo)的影響。添加微生物發(fā)酵劑能降低產(chǎn)品pH值,抑制亞硝酸鹽的生成,減緩香腸脂肪氧化酸敗的程度,提高抑菌能力;其中復(fù)配菌組的各項(xiàng)指標(biāo)均在不同程度上優(yōu)于自然發(fā)酵組,色澤亮紅,彈性好;同時(shí)感官評(píng)分結(jié)果表明,接種發(fā)酵劑具有一定改善香腸滋氣味和外觀的效果,可以更好彌補(bǔ)香腸中為提高安全性而帶來(lái)口感上的缺失。因此,添加發(fā)酵劑能改善川味牦牛肉香腸的品質(zhì)和食用安全性,其中采用彎曲乳桿菌和植物乳桿菌復(fù)配(1∶1)所生產(chǎn)出來(lái)的川味牦牛肉香腸的品質(zhì)最優(yōu),可以為后續(xù)進(jìn)一步研究?jī)煞N復(fù)配菌發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。