苦蕎酒糟黃酮富集生產苦蕎蒸餾酒的研究

張鵬杰，甘霖耀，孫金旭，郭凱凱，陳葉福，肖冬光，郭學武，2*

（1.天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；2.河北省濕地保護與綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 衡水 053000；3.衡水學院 生命科學學院，河北 衡水 053000）

白酒是一種源于中國的獨特的蒸餾酒[1]。2022年全國釀酒行業(yè)完成產品銷售收入9 509.0億元，累計實現(xiàn)利潤總額2 491.5億元，其中白酒行業(yè)完成銷售收入6 626.5億元，實現(xiàn)利潤2 201.7億元，白酒在國民經濟建設中起著重要的作用。近年來，人們對于健康的意識增強，功能保健型白酒研發(fā)是中國行業(yè)發(fā)展的新趨勢。傳統(tǒng)白酒是糧谷為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，通過固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾而得[2]。進入21世紀后，先進分析儀器的使用，尤其是氣相色譜-質譜聯(lián)機、高效液相色譜-質譜聯(lián)用等分析技術的應用，已在白酒中檢出2 000多種成分，包括酯類、醇類、酸類、吡嗪類、萜烯類、呋喃類、芳香類化合物等多種有益健康成分[3]。一般來說，白酒中的健康因子有兩種來源：一種是在白酒復雜的釀造工藝中由釀酒微生物代謝產生；另一種是由釀酒原料本身帶入。然而，這些因子所產生的健康促進作用仍然相對受限。因此，健康白酒研究的關注一直在穩(wěn)步加強[4-5]。近年來，利用中藥以及某些具有健康因子的釀造原料賦予白酒更加豐富的風味與保健功能的研究日漸增多[6-7]，然而發(fā)酵型保健酒中部分活性成分易殘留在酒糟，未能充分利用[8]。

苦蕎麥（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.）是起源于我國西南地區(qū)的一種重要的藥食同源作物，富含維生素和膳食纖維等多種營養(yǎng)物質與生物類黃酮[9-10]。研究表明，苦蕎中黃酮具有降低血糖，降低血脂等多種保健及藥理功能[11-13]，因此苦蕎酒中含有的黃酮類物質使其具有一定的保健作用[14-15]。但受限于白酒蒸餾工藝及黃酮類物質的理化性質，其無法蒸餾至酒體而殘留于酒糟中，苦蕎功能性成分未能得到合理利用[16-17]。周清華等[18]研究出一種黃酮含量達15.27 mg/mL的苦蕎浸泡酒工藝，但浸泡時間較長，黃酮類物質利用率不高。湯燾[19]利用苦蕎酒糟提取物復配得到優(yōu)質苦蕎酒，為黃酮類物質的充分利用提供了一種開發(fā)方向。

超聲波輔助提取苦蕎黃酮具有設備成本較低和有機溶劑殘留較少的特點。然而，其提取物純度相對較低[20-23]。近年來，大孔樹脂已在中草藥有效成分的分離和純化領域得到廣泛應用[24-27]，這主要歸功于其穩(wěn)定的理化性質、環(huán)保優(yōu)勢以及操作簡便等特點[28]。李姝等[29]發(fā)現(xiàn)，大孔樹脂在純化苦蕎黃酮過程中，無需經過再生處理，且具備多次使用的優(yōu)勢。因此，該研究為開發(fā)富含黃酮類物質的苦蕎酒，通過優(yōu)化苦蕎酒糟總黃酮超聲提取工藝，在超聲提取的基礎上優(yōu)化了AB-8型大孔樹脂純化苦蕎酒糟總黃酮提取物工藝，并得到一種苦蕎蒸餾酒的配制方案。旨在為苦蕎酒糟中總黃酮化合物的工業(yè)化回收利用提供一種新的實驗方法以及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥：云南昆明；大米：天津小站稻米；根霉曲：昆明市顯貢祥勝酒曲廠；釀酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；D61、001X7樹脂：天津南大樹脂科技有限公司；D71、AB-8、D301R樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；D151樹脂：蚌埠東立化工有限公司；蘆丁標準品（純度≥98.0%）：北京百靈威科技有限公司；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市江天化工技術股份有限公司；乙酸鉀（分析純）：天津市永大化學試劑開發(fā)中心；三氯化鋁（分析純）：天津市百世化工有限公司。

1.2 儀器與設備

ATP-3200蠕動泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；7230G紫外分光光度計：上海普天分析儀器有限公司；SY-300超聲波萃取儀：上海寧商超聲儀器有限公司；RE201D旋轉蒸發(fā)儀：上海博彩儀器有限公司；LD5-10低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 方法

1.3.1 富含黃酮苦蕎蒸餾酒制備工藝流程及操作要點

操作要點：

原料處理：選取籽粒豐滿，無空殼和霉變的苦蕎麥；大米需色澤明亮、均勻和黃斑；苦蕎麥與大米質量比為3∶7，洗至清澈無渾濁，補充適量水浸泡6 h。

蒸料糊化：浸泡結束后，蒸煮30～40 min，蒸好的原料疏松不糊，均勻一致。

培菌糖化：蒸煮結束后，冷卻至30 ℃左右，加入原料質量2%的根霉曲，攪拌均勻，裝瓶，用紗布封口并置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，培菌糖化24 h。

活性干酵母活化：稱取原料質量0.1%的釀酒活性干酵母，按1 g溶于20 mL 4%葡萄糖溶液的比例將其溶解，置于30 ℃下活化0.5～1.0 h。

發(fā)酵：將活化后的活性干酵母加入培菌糖化后的原料中，在30 ℃下發(fā)酵5～7 d。

蒸餾：待發(fā)酵結束后，將發(fā)酵醪加適量水稀釋至酒精度10%vol左右，再加入上次蒸餾的酒尾，加熱開始蒸餾，視酒質情況取初餾酒頭1%～2%；繼續(xù)蒸餾接酒，一直到混合酒液的酒精度為63%vol左右，此為酒基；以后即為酒尾，單獨接取，酒尾的大部分摻入下次蒸餾。

苦蕎酒糟超聲提?。悍Q取晾干的苦蕎酒糟5.00 g，加入不同體積分數(shù)乙醇溶液，超聲提取，離心過濾，以乙醇溶液定容至250 mL，在不同超聲功率下進行提取。

大孔樹脂純化：將一定體積超聲提取液經旋轉蒸發(fā)儀（40～60 MPa真空，溫度50 ℃）濃縮至膏狀，再用等體積的去離子水復溶，抽濾得清液，備用，稱取一定量樹脂，加入樣品液后振搖一段時間，洗脫。

濃縮、干燥：將經大孔樹脂純化所得樣品蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，再倒入潔凈平板，30 ℃恒溫箱中干燥成粗粉末。

復配：酒基與酒尾按照一定量比例配制，梯度加入不同量酒糟純化黃酮提取物，即得富含黃酮苦蕎蒸餾酒。

1.3.2 苦蕎酒糟黃酮超聲提取工藝優(yōu)化單因素試驗

稱取晾干的苦蕎酒糟5.00 g，加入一定體積分數(shù)乙醇溶液，500 W超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，過濾，以乙醇溶液定容至250 mL。測定樣品的總黃酮含量，以總黃酮得率為評價指標，分別考察超聲功率（300 W、400 W、500 W、600W、700W）、乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）（g∶mL）和提取時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）4個因素對超聲提取酒糟總黃酮得率的影響。

1.3.3 苦蕎酒糟黃酮超聲提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇超聲功率（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、料液比（C）和提取時間（D）為評價因素，以總黃酮得率為評價指標，設計并進行正交試驗，超聲提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平見表1。

表1 苦蕎酒糟黃酮超聲提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for flavonoids extraction conditions optimization from buckwheat distiller's grains by ultrasonic

1.3.4 苦蕎酒糟黃酮純化工藝（1）樹脂的選擇與處理

選取D151、D61、D71、AB-8、001×7和D301R大孔樹脂進行試驗，樹脂預處理：將樹脂用體積分數(shù)95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后用蒸餾水洗至無醇，然后用5%鹽酸溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；最后用5%氫氧化鈉溶液浸泡12 h，再用蒸餾水洗至中性，備用；利用不同的樹脂進行苦蕎酒糟總黃酮粗提液的靜態(tài)吸附和解吸，分別計算其靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率。

（2）吸附條件優(yōu)化

以選出的最佳大孔樹脂對樣品進行純化，以吸附率、解吸率及黃酮含量為評價指標，分別研究了上樣pH（3、4、5、6、7）、上樣流速（1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min、4 mL/min、5 mL/min）、上樣質量濃度（0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL）對大孔樹脂動態(tài)吸附率的影響，以及洗脫劑用量（每5 mL進行一次測定）、洗脫劑（乙醇）體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%和90%）和洗脫流速（1 mL/min、3 mL/min、5 mL/min、7 mL/min、9 mL/min、11 mL/min、13 mL/min、15 mL/min、17 mL/min）對大孔樹脂動態(tài)洗脫效果的影響。

1.3.5 純度與吸附率的計算

（1）純度的計算

將經大孔樹脂純化所得樣品蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，再倒入潔凈平板，30 ℃恒溫箱中干燥成粗粉末，選擇其中一部分用適量體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，測定溶解液總黃酮質量濃度，計算經大孔樹脂純化所得樣品收集液的純度，其計算公式如下：

（2）吸附率的計算

取干燥樹脂1.00 g，精確至0.001，加入100 mL樣品（0.2 mg/mL），100 r/min振搖1 d，過濾，用樣品等體積的蒸餾水沖洗樹脂，使用等體積的體積分數(shù)70%乙醇溶液溶解樣品中總黃酮物質，相同條件振搖1 d，過濾，計算各型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附率及解吸率，其計算公式如下：

取干燥大孔樹脂1.00 g，加入適量總黃酮質量濃度為0.2 mg/mL的樣品，以每分鐘為單位進行取樣，每次1 mL，在時間達到20 min后，將取樣時間間隔更改為10 min一次，測定樣品質量濃度。以時間為橫坐標，總黃酮質量濃度為縱坐標繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.3.6 理化指標測定

酒精度的測定：按照國家標準GB 5009.225—2023《食品安全國家標準酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》中酒精計法[30]?？傸S酮含量測定方法參照李欣等[31]的方法，以吸光度值（x）為橫坐標，蘆丁標準品質量濃度（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，根據(jù)標準曲線回歸方程y=0.030 98x-0.000 25（R2=0.999 8）計算提取液中總黃酮含量（以蘆丁計），總黃酮得率計算公式如下：

1.3.7 富含黃酮的苦蕎蒸餾酒的配制

測定酒基與酒尾的酒精度，根據(jù)基酒酒精度為55%vol確定酒基與酒尾比例[18]；酒糟黃酮提取液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮至膏狀后置于干凈玻璃平板中，30 ℃恒溫干燥至粉末狀。添加一定量的苦蕎酒糟黃酮提取物使酒中總黃酮提取物含量約為250 mg/L、400 mg/L、600 mg/L和800 mg/L，對酒體進行感官評價。

1.3.8 感官評定方法

參照GB/T 33405—2016《白酒感官品評術語》[32]、GB/T 33404—2016《白酒感官品評導則》[33]等相關標準，選擇10人組成品鑒小組，其中包括研究白酒風味的8名研究生和2名國家白酒評委，對添加不同含量苦蕎黃酮提取物的苦蕎蒸餾酒進行品評，分別從酒體顏色及清亮程度、苦蕎香明顯程度、口感醇和度與苦味適宜程度四個方面進行綜合品評，結果取平均值，每項評分滿分按10分記。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016計算分析數(shù)據(jù)；使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲提取條件優(yōu)化

2.1.1 超聲提取條件優(yōu)化單因素試驗

預試驗中對酒頭、酒基與酒尾中的物質進行了測定，均未檢測到黃酮類物質，說明蒸餾出的酒樣中不含黃酮類物質。對苦蕎酒糟中黃酮類物質進行超聲提取和測定，不同提取條件對總黃酮得率的影響結果見圖1。

圖1 超聲功率（a）、乙醇體積分數(shù)（b）、料液比（c）和超聲時間（d）對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power (a), ethanol concentration (b), material-to-liquid ratio (c) and ultrasonic time (d) on the yield of flavonoids

由圖1a可知，超聲功率對苦蕎酒糟總黃酮得率影響呈先增大后減小的趨勢，超聲功率為500 W時，總黃酮得率達到最大；超聲功率＞500 W時，總黃酮得率開始呈現(xiàn)出遞減趨勢，可能是由于合適的功率能更加高效的破碎細胞，從而更加有效地提取出成分[34]，而超聲功率過高或者過低會使得有效物質的提取受到影響；因此，選取400 W、500 W、600 W進行正交試驗。由圖1b可知，總黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的升高而提高，是由于乙醇體積分數(shù)的增加，溶液極性隨著乙醇體積分數(shù)不斷升高而減小，與黃酮類化合物的親和性變大，因此選取乙醇體積分數(shù)70%、80%與90%進行正交試驗。由圖1c可知，隨著料液比的增加，總黃酮得率隨著液體比例的增大呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，或許是水的增加影響了酒糟的極性，導致其加強了對黃酮物質的吸附，導致提取更加困難；而料液比低于1∶10（g∶mL）時不利于試驗進行，因此，迭取料液比1∶10、1∶20及1∶30（g∶mL）進行正交試驗。由圖1d可知，隨著超聲時間的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)出增加的趨勢。當超聲時間＜30 min時，總黃酮得率隨著超聲時間的延長呈現(xiàn)出較快的增長趨勢，當超聲時間達到40 min后，總黃酮得率與最初相比增長了一倍有余；但在超聲時間達到40 min后，增長趨于平緩，考慮時間及經濟因素，選取30min、40 min、50 min進行正交試驗。

2.1.2 正交試驗設計與結果

根據(jù)單因素試驗結果，以超聲功率（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、料液比（C）和超聲時間（D）為評價因素，以總黃酮得率為評價指標設計正交試驗，結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 苦蕎酒糟黃酮超聲提取條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for flavonoids extraction conditions optimization from buckwheat distiller's grains by ultrasonic

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results

由表2可知，各因素影響超聲提取總黃酮得率的順序為B＞D＞A＞C，即乙醇體積分數(shù)＞超聲時間＞超聲功率＞料液比；由表3可知，乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲功率及料液比對于超聲提取工藝影響程度各不相同。其中，乙醇體積分數(shù)（B）與超聲時間（D）因素對結果影響極顯著（P＜0.01），超聲時間（A）與料液比（C）對結果影響因素（P＜0.05）。根據(jù)極差分析結果得出，苦蕎酒糟黃酮超聲提取的最佳工藝條件為A3B3C3D3，在此工藝條件下，總黃酮得率為0.90%，干燥后黃酮粉末純度為38.3%。

曹婭等[35]在響應面優(yōu)化苦蕎黃酮超聲波提取工藝中得到總黃酮提取率最高為2.26%；李欣等[31]通過超聲提取苦蕎黃酮平均得率為2.70%與2.35%。由于本試驗以苦蕎麥和大米混料發(fā)酵，其中苦蕎麥占30%，因此通過超聲提取苦蕎酒糟得率為0.9%已較為理想，在優(yōu)化后的超聲提取條件下可以有效的提取苦蕎酒糟黃酮，但其黃酮提取物干燥后的粉末純度僅為38.3%，純度并不理想，具有進一步純化的空間，因此選擇大孔樹脂對其進行純化處理。

2.2 大孔樹脂純化工藝研究

2.2.1 大孔樹脂的篩選

6種大孔樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率測定結果見圖2。

圖2 6種大孔樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率Fig.2 Static adsorption and desorption rates of 6 macroporous resins

由圖2可知，D151、D61、D71、AB-8、001X7、D301R型樹脂對苦蕎酒糟黃酮的靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸效果各不相同。AB-8型樹脂和D301R型樹脂的靜態(tài)吸附率明顯高于其他型號，且D61型樹脂吸附率和解析率均略高于另外三種樹脂；因此選取AB-8、D301R和D61型樹脂進行吸附動力學試驗，結果見圖3。

圖3 樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Static adsorption curve of resin

由圖3可知，AB-8和D301R型樹脂均在短時間內基本完成了對黃酮類化合物的吸附，隨著時間增加黃酮質量濃度基本維持不變；其次，在此時間內AB-8樹脂的吸附動力學曲線斜率優(yōu)于D301R樹脂。上述分析表明，用于苦蕎酒糟黃酮純化的最佳大孔樹脂為AB-8型。

2.2.2 AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附研究

不同的pH、上樣流速和上樣質量濃度對大孔樹脂吸附率的影響結果見圖4。

圖4 pH（a）、上樣流速（b）和上樣質量濃度（c）對AB-8大孔樹脂吸附率的影響Fig.4 Effect of pH(a),loading flow rate(b)and loading concentration(c)on adsorption rate of macroporous resin AB-8

由圖4a可知，上樣液pH＜4時，樹脂吸附率逐漸升高，當上樣液pH為4時AB-8樹脂的吸附率最高，當pH＞4時，吸附率呈現(xiàn)出快速的下降趨勢；因此，選擇pH=4作為上樣液的最佳pH。由圖4b可知，隨著上樣流速的增加，樹脂吸附率呈先升高后降低的趨勢，當上樣流速為2 mL/min時吸附率最高，當上樣流速＞2 mL/min后吸附率開始下降，且流速越快下降趨勢越明顯；因此，苦蕎酒糟黃酮粗提液純化的最佳上樣流速為2 mL/min。由圖4c可知，隨著上樣質量濃度的增加，AB-8樹脂對樣品的吸附率逐漸減小；當上樣質量濃度由0.1 mg/mL增加至0.2 mg/mL時，吸附率略微下降，超過0.2 mg/mL后開始迅速下降，但同時間內0.2 mg/mL的上樣質量濃度所處理的樣品體積更多；因此，進行純化的樣品最佳質量濃度為0.2 mg/mL。

2.2.3 動態(tài)解吸研究

洗脫液體積、乙醇體積分數(shù)和洗脫流速對黃酮提取物洗脫效果的影響見圖5。

圖5 洗脫液體積（a）、乙醇體積分數(shù)（b）和洗脫流速（c）對黃酮提取物洗脫的影響Fig.5 Effect of eluent volume (a), ethanol volume fraction (b) and elution flow rate (c) on the elution of flavonoid extracts

由圖5a可知，隨著洗脫液體積的增加，總黃酮質量濃度快速升高，當洗脫液體積為10 mL時達到最高，隨后開始快速減少，當洗脫液體積增加至40 mL時，總黃酮質量濃度下降趨勢逐漸平穩(wěn)；當體積增加至50 mL時，黃酮物質基本被洗脫；綜合考慮洗脫效果及洗脫劑的成本，50 mL是洗脫液體積的最佳選擇。由圖5b可知，洗脫率隨著乙醇體積分數(shù)的上升而增加。當乙醇體積分數(shù)上升至70%后，洗脫率上升趨勢逐漸緩慢；故選取體積分數(shù)為70%作為乙醇溶液的最佳洗脫體積分數(shù)。由圖5c可知，當洗脫流速＜11 mL/min時，洗脫率雖有略微起伏，但幾乎維持不變；當洗脫流速＞11 mL/min以后，洗脫率開始快速降低，洗脫流速11 mL/min時在相同時間內純化樣品體積更多，純化效率更優(yōu)，因此最佳洗脫流速為11 mL/min。

綜上，AB-8大孔樹脂純化苦蕎酒糟黃酮的最佳工藝為：上樣pH 4、上樣流速2 mL/min、上樣質量濃度0.2 mg/mL、50 mL體積分數(shù)70%乙醇洗脫、洗脫流速11 mL/min；經過此工藝條件下大孔樹脂純化的苦蕎酒糟黃酮提取物純度為85.36%，相比于超聲提取法所獲得的黃酮提取物純度有了大幅度提高，提升了47.06個百分點。

2.3 富含黃酮的苦蕎蒸餾酒的配制

蒸餾前50 mL得到的酒液為酒頭，之后得到酒精度為63%vol的酒基及20%vol的酒尾。當酒基與酒尾按照100∶23（V/V）配制時，酒精度為55%vol，此時酒體風味協(xié)調，口感較好。對不同添加量純化黃酮提取物的酒體進行感官評價，結果見圖6。

圖6 富含黃酮的苦蕎蒸餾酒感官評價結果Fig.6 Sensory evaluation results of buckwheat distilled spirits enriched with flavonoid

由圖6可知，當復配型苦蕎蒸餾酒中總黃酮提取物含量為400～600 mg/L時，顏色較好，為微黃清亮，具有獨特的有苦蕎香的同時，又不會因添加過高的黃酮提取物賦予酒過重的苦味，苦味溫和不突出，口感良好。

3 結論

本試驗使用苦蕎、大米發(fā)酵制作苦蕎蒸餾酒，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化苦蕎酒糟黃酮超聲提取與大孔樹脂純化工藝，得到黃酮提取物純度為85.36%，添加黃酮提取物至苦蕎蒸餾酒中，制作出一款酒精度為55%vol、黃酮提取物含量為400～600 mg/L的復配型苦蕎蒸餾酒，該酒顏色良好、苦味適宜，具有苦蕎酒獨特的香味。本研究的結果對于解決傳統(tǒng)苦蕎酒釀造過程中對苦蕎生物類黃酮資源利用率低的問題具有一定的理論和實際意義，為更好的利用苦蕎麥資源提供了參考依據(jù)。