青稞蕨麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化及其品質(zhì)評價

文華英，王傅玉，張玉紅*

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

食用植物酵素是以植物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可食用的酵素產(chǎn)品[1]，具有美容養(yǎng)顏、降脂、解酒、促進消化等[2-3]功效。以原料種類為劃分依據(jù)可分為包括谷物酵素、水果酵素、蔬菜酵素和藥食同源植物酵素類酵素等在內(nèi)的單一型酵素和復(fù)合型酵素[4]。研究表明，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵不僅提高酵素的黃酮等功能性成分含量和人體吸收率[5-9]，還增加芳香化合物含量[10]改善風(fēng)味。藥食兩用植物酵素兼具食藥兩用特點，經(jīng)微生物發(fā)酵溶出功效酶、多酚、有機酸和多糖等多種活性成分，能降低活性氧引起的機體傷害[11]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是酵素的功效酶之一，可催化超氧陰離子自由基（O2-·）歧化成分子氧和過氧化氫[12]，是生物體內(nèi)O2-·的天然消除劑，是抗氧化酶防御系統(tǒng)的第一道和最重要的一道防線[13]，在應(yīng)對氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[14]，保護生物體細胞。

青稞（Hordeum vulgareL.）為大麥屬禾谷類作物[15]，富含β-葡聚糖、多酚等功能因子，具有抗氧化、抗腫瘤、降糖、抗心血管疾病等多種生物活性，因此青稞具有改善人體生理功能的潛力[16]。蕨麻（Potentilla anserinaL.），藏文中又稱“延壽草”、“仙人果”和“戳瑪”等，是食藥兩用植物，為薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的塊根，具有悠久的食用歷史，在我國主要分布在青藏高原地區(qū)[17-18]。多糖、黃酮和皂苷等活性物質(zhì)賦予蕨麻顯著的抗缺氧、抗氧化、增強免疫力和保肝等功效[19-21]。目前，對青稞食飲品的研究有青稞酒類、青稞面包、青稞蛋糕、能浸泡出功能成分的烘焙青稞、通過藏靈菇發(fā)酵富集青稞中β-葡聚糖和γ-氨基丁酸等[22-28]，對蕨麻也有蕨麻酸奶、蕨麻蘇打餅干、未發(fā)酵的蕨麻復(fù)合飲料等[29-31]研究，而酵素類飲品的研究較少報道。

該研究以16株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為研究對象，對其酸、糖耐受性進行分析，選取一株耐受性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株，并以篩選菌株為發(fā)酵劑，青稞、蕨麻為主要原料制備青稞蕨麻酵素。以超氧化合物歧化酶（SOD）酶活性為響應(yīng)值，采用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對其發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，并對其理化指標(biāo)及抗氧化活性進行分析，以期為研發(fā)含高抗氧化性的青稞蕨麻酵素功能飲品提供參考，豐富青稞和蕨麻資源應(yīng)用的多樣性，為開發(fā)具備抗氧化功能的食藥同源型酵素提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

青稞和蕨麻：購自拉薩市場；試驗涉及的16株植物乳桿菌由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所保存，分別為LL1-5、LL1-6、LL2-3、LL2-4、LL3-3、LL3-4、LL4-5、LL5-2、LL5-3、LL5-4、LL6-1、LL6-2、LL6-6、LL7-1、LL7-3和LL7-4。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；可滴定酸檢測試劑盒：上海撫生實業(yè)有限公司；氨基酸含量檢測試劑盒、還原糖含量檢測試劑盒、SOD酶活性檢測試劑盒、鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）測定試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子（O2-·）自由基測定試劑盒、羥自由基（·OH）測定試劑盒、植物總酚檢測試劑盒、植物類黃酮檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7502PCS紫外-可見光分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；K6600-B酶標(biāo)儀：北京凱奧科技發(fā)展有限公司；PH400 pH計：科邦檢測集團有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TS-5000Z日本INSENT味覺分析系統(tǒng)：北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞蕨麻酵素加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料準備：挑選籽粒飽滿軟硬適中的青稞40 g，清洗干凈后加入約2/3質(zhì)量的無菌水浸泡24 h，煮至爆腰后控干晾涼至28 ℃?zhèn)溆?。干蕨麻洗凈后晾干，用粉碎機粉碎后過100目篩，并稱取20 g蕨麻粉與青稞混合。

拌曲糖化：向青稞蕨麻混合物中接入甜酒曲[32]（0.15 g甜酒曲/10 g干物料），拌曲搭窩，在30 ℃下密封糖化1.5 d。

加糖滅菌：添加一定量的糖可為微生物提供合適的碳源[33]并提升發(fā)酵產(chǎn)品的口感，向糖化結(jié)束后的半固體物料中補充18 g白砂糖和150 g無菌水，85 ℃下保溫2 h滅菌，晾涼至室溫。

接種發(fā)酵：按3%（V/V）接入篩選菌株，混勻后在35 ℃條件下發(fā)酵5 d。

離心滅菌：發(fā)酵結(jié)束后紗布過濾，室溫條件下4 500 r/min離心10 min后分離取上清液，60 ℃巴氏殺菌30 min后即得成品。

1.3.2 發(fā)酵劑的篩選

（1）植物乳桿菌種子液的制備

將-80 ℃條件下保存的16株植物乳桿菌解凍后于MRS平板上劃線，挑取單菌落入MRS液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下恒溫靜置活化16～18 h，重復(fù)活化2～3次后制備成107～108CFU/mL的菌懸液備用。

（2）耐酸能力測定和耐糖能力測定

用2 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制不同pH值（3.0、3.5、4.0）的MRS液體培養(yǎng)基，用無水葡萄糖配制不同含糖量（25%、30%、35%）的MRS液體培養(yǎng)基。將上述菌懸液以1%（V/V）的接種量分別接種于上述培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值，以未處理的MRS液體培養(yǎng)基為對照，按照以下公式計算存活率：

式中：A為生長在酸化或糖化處理的MRS液體培養(yǎng)基中植物乳桿菌的OD600nm值；B為生長在未處理的MRS液體培養(yǎng)基中植物乳桿菌的OD600nm值。

（3）生長曲線和產(chǎn)酸曲線測定

菌懸液以1%（V/V）接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。生長曲線的取樣時間為：前16 h內(nèi)，每隔2 h取樣一次，16～48 h內(nèi)，每隔4 h取樣一次測定菌液OD600nm值；產(chǎn)酸曲線的取樣時間為：前8 h內(nèi)，每隔2 h取樣一次，8～48 h內(nèi)，每隔4 h取樣一次測定pH值。

1.3.3 青稞蕨麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗：采用單因素輪換法分別考察蕨麻添加量（2.4%、4.8%、7.2%、9.6%、12.0%）（以干青稞和糖水的質(zhì)量計）、發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對青稞蕨麻酵素SOD酶活性的影響。

響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取蕨麻添加量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以SOD酶活性（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken試驗對青稞蕨麻酵素發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

（1）理化指標(biāo)和體外抗氧化能力檢測

總酸含量、氨基酸含量、還原糖含量、總酚含量、類黃酮含量、SOD酶活性、鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH·清除能力、抑制O2-·能力、·OH清除能力：均采用相應(yīng)試劑盒進行檢測。

（2）電子舌檢測

進樣體積25 mL，數(shù)據(jù)采集時間120 s，采集周期1 s，清洗時間為10 s。電子舌所得所有數(shù)據(jù)均是以人工唾液（參比溶液）為標(biāo)準的絕對輸出值，電子舌測試人工唾液的狀態(tài)，模擬人口腔中只有唾液時的狀態(tài)。其中參比溶液的輸出值為無味點（tasteless），參比溶液（reference）由氯化鉀和酒石酸組成味覺值。每份樣品按照平行測試5次，進行分析處理。導(dǎo)出數(shù)據(jù)時，將響應(yīng)值轉(zhuǎn)化成味覺值，開展后續(xù)分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次，利用Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面設(shè)計，Origin 2021軟件作圖，SPSS 21統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑的篩選

2.1.1 耐酸能力測定不同菌株對pH值的耐受性試驗檢測結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌株對pH值的耐受性Fig.1 Tolerance of different strains to pH

由圖1可知，低酸環(huán)境對16株植物乳桿菌的生長有明顯抑制作用。pH 4.0條件下，16株菌株存活率為37.38%～61.05%，其中菌株LL6-1的存活率最高，為61.05%，與其余菌株有顯著差異（P＜0.05）；其次為菌株LL7-4和LL6-6，其存活率分別為58.21%、58.18%。pH 3.5條件下，16株菌株存活率為11.0%～30.34%，其中菌株LL6-1的存活率最高，為30.34%，與其余菌株有顯著差異（P＜0.05）；其次為菌株LL6-2和LL7-4，其存活率分別為29.53%、29.08%。pH 3.0條件下，16株菌株存活率為1.51%～4.26%，其中菌株LL7-4、LL6-2、LL7-3和LL6-1較高，均＞4.00%，4株菌的存活率無顯著差異（P＞0.05）；綜上可知，菌株LL6-1的耐酸能力較高。

2.1.2 耐糖能力測定

不同菌株對葡萄糖含量的耐受性試驗結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌株對葡萄糖含量的耐受性Fig.2 Tolerance of different strains to glucose contents

由圖2可知，葡萄糖含量為25%時，16株菌株存活率為26.85%～29.76%，其中菌株LL6-1和LL1-6存活率較高，分別為29.76%、29.40%，二者無顯著差異（P＞0.05）。葡萄糖含量為30%時，菌株存活率為18.48%～21.37%，其中菌株LL6-1、LL5-2和LL4-5存活率較高，分別為21.37%、21.35%和21.08%，三者無顯著差異（P＞0.05）。葡萄糖含量為35%時，16株菌存活率為12.10%～19.00%，其中菌株LL5-2、LL6-1和LL7-4存活率較高，分別為19.00%、18.64%、18.13%，三者無顯著差異（P＞0.05）。綜上可知，菌株LL6-1的耐糖能力較高。因此，選擇耐酸和耐糖能力均較強的菌株LL6-1為發(fā)酵劑。

2.1.3 生長曲線和產(chǎn)酸曲線測定

菌株LL6-1的生長曲線和產(chǎn)酸曲線見圖3。由圖3可知，菌株LL6-1無生長停滯期，直接進入對數(shù)生長，培養(yǎng)20 h進入生長穩(wěn)定期直至48 h，可見其生長速度較快；此外，隨著菌株LL6-1的生長，0～16 h內(nèi)菌液的pH值呈持續(xù)下降趨勢，當(dāng)培養(yǎng)16 h時，pH值降至4.0，16～48 h趨于平穩(wěn)，最終降至3.74，產(chǎn)酸能力較強。

圖3 菌株LL6-1的生長曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.3 Growth curve and acid production curve of strain LL6-1

2.2 青稞蕨麻酵素發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

利用單因素試驗考察蕨麻添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度3個因素對酵素SOD酶活性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果Fig.4 Results of single factor tests for fermentation conditions optimization

由圖4A可知，當(dāng)蕨麻添加量為2.4%～12.0%時，SOD酶活逐漸增加；當(dāng)蕨麻添加量為9.6%時，SOD酶活達到最大值，為4 915.57 U/mL；當(dāng)蕨麻添加量＞9.6%時，SOD酶活有所下降。因此，確定最適蕨麻添加量為9.6%。由圖4B可知，當(dāng)發(fā)酵時間為1～4 d時，SOD酶活性逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵時間為4 d時，SOD酶活性達到最大，為10 718.21 U/mL；當(dāng)發(fā)酵時間＞4 d時，SOD酶活性逐漸下降。隨著發(fā)酵時間的延長，體系中有機酸酸含量增加pH值降低，降低了SOD酶活性，與程楊等[23]結(jié)果一致。因此，確定最適發(fā)酵時間為4 d。圖4C可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為15～30 ℃時，SOD酶活性逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，SOD酶活性達到最高值，為6 626.32 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度＞30 ℃，SOD酶活性有所下降，這與程楊等[34]的研究結(jié)果基本一致。因此，確定最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取蕨麻添加量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以SOD酶活性（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

通過響應(yīng)面回歸分析，獲得各因素對SOD酶活性的二次回歸方程：

Y=1 112.07+3.93A-11.38B+7.16C-18.36AB-4.71AC-5.53BC-

335.28A2-154.75B2-158.44C2

由表3可知，該二次方程模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P值=0.465 6＞0.05），決定系數(shù)R2=100%，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=100%，表明該模型擬合程度良好，可用該模型推測試驗結(jié)果。由P值可知，一次項、二次項及交互項均對SOD酶活性的影響極顯著（P＜0.01）。由F值可知，影響SOD酶活性的各因素主次順序為：發(fā)酵時間（B）＞發(fā)酵溫度（C）＞蕨麻添加量（A）。

響應(yīng)曲面坡度越陡，等高線越密集，表明交互作用顯著。各因素之間交互作用對SOD酶活性影響的3D響應(yīng)曲面見圖5。由圖5可知，蕨麻添加量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）因素之間交互作用均極顯著（P＜0.05）。這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素間交互作用對超氧化歧化酶酶活性影響的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface plots of interaction between various factors on the superoxide dismutase activity

2.2.3 驗證試驗

利用Design-Expert 8.0軟件分析得到青稞蕨麻酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為：蕨麻添加量9.62%、發(fā)酵時間3.96 d、發(fā)酵溫度30.11 ℃，在此優(yōu)化條件下，青稞蕨麻酵素的SOD酶活性預(yù)測值為1 112.38 U/mL。為方便操作，將發(fā)酵條件修正為：蕨麻添加量9.6%、發(fā)酵時間4 d和發(fā)酵溫度30 ℃，試驗重復(fù)3次，SOD酶活性實際值為1 112.07 U/mL，實際值接近預(yù)測值，說明模型有效，此酵素的SOD酶活性符合QB/T5323—2018《植物酵素》[34]規(guī)定的SOD酶活性≥15 U/L的要求。

2.3 酵素的理化指標(biāo)及抗氧化活性分析

酵素的理化指標(biāo)及抗氧化活性檢測結(jié)果見表4。由表4可知，青稞蕨麻酵素總酸含量為3.93%，滿足液態(tài)食用植物酵素總酸含量0.8 g/100 g的要求[35]。除了含有氨基酸和還原糖，該酵素還含有多酚和類黃酮活性物質(zhì)，說明其有一定抗氧化功能，其DPPH·、O2-·和·OH清除或抑制能力以及鐵離子還原/抗氧化能力分別為1 710.18 μg Trolox/mL、777.17 U/L、1 701.31 U/mL和6.39 μmol/mL，表明青稞蕨麻酵素具有抗氧化活性。

表4 酵素的理化指標(biāo)及抗氧化活性檢測結(jié)果Table 4 Determination results of physicochemical indexes and antioxidant activities of Jiaosu

2.4 酵素的電子舌分析

對照無味點[36]分析青稞蕨麻酵素的味覺特征，電子舌味覺分析雷達圖見圖6。

圖6 電子舌分析雷達圖Fig.6 Radar map of electronic tongue analysis

由圖6可知，青稞蕨麻酵素的咸味和豐富度（鮮味回味）低于無味點，苦味回味和澀味回味接近無味點，表明品嘗該酵素時不能嘗出咸味和豐富度（鮮味回味），且很難嘗出苦味回味和澀味回味。酸味、苦味、甜味、澀味和鮮味高于無味點，說明這5味是該酵素的味覺指標(biāo)，其中酸味最突出，苦味次之，若食用需增加甜味改善口感。

3 結(jié)論

本研究以青稞、蕨麻為主要原料制備酵素，以SOD酶活性為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為蕨麻添加量9.6%、發(fā)酵時間4 d、發(fā)酵溫度30 ℃。在此優(yōu)化條件下，SOD酶活性為1 112.07 U/mL?？偹?、還原糖、氨基酸、總酚、類黃酮含量分別為3.93%、29.22 mg/mL、1.06 μmol/mL、3.03 mmol/L、184.91 mg/L。此外，其DPPH·、O2-·和·OH清除或抑制能力以及鐵離子還原/抗氧化能力分別為1 710.18 μg Trolox/mL、777.17 U/L、1 701.31 U/mL和6.39 μmol/mL，表明青稞蕨麻酵素具有抗氧化活性。本研究不僅豐富了青稞和蕨麻酵素產(chǎn)品種類，還為植物乳桿菌發(fā)酵制備抗氧化功能的青稞蕨麻酵素提供數(shù)據(jù)支持。