苦參素對肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM的作用及機(jī)制研究

王昭輝 王國興 郭東雅

肝癌是全球第二大惡性腫瘤,其發(fā)生率和致死率僅次于肺癌,放化療是臨床上治療肝癌的常用手段,但長期使用化療藥物會導(dǎo)致患者出現(xiàn)耐藥性,因此大大降低了臨床療效[1]。傳統(tǒng)中藥因多靶點、低毒性的優(yōu)點受到學(xué)者廣泛關(guān)注,苦參素又名氧化苦參堿,是從中藥苦參中提取分離得到的一種生物堿,具有廣泛抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn),苦參素可增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤效果,提高肝癌荷瘤小鼠免疫功能[2]?？鄥⑺乜梢种聘伟〩epG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,降低癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路激活與多種惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān),過表達(dá)miR-429可通過抑制ERK/MAPK信號通路降低肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。白芥子穴位貼敷通過阻礙ERK1/2激活可抑制肝癌H22移植瘤生長[5]?；谝陨峡鄥⑺睾虴RK/MAPK信號通路在肝癌中的相關(guān)研究,本研究主要探討苦參素是否能通過抑制ERK/MAPK信號通路逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞化療藥物耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞株HepG2和人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM均購自美國ATCC公司。

1.2 試劑和儀器

苦參素購自寶雞市萬晟生物開發(fā)有限公司;培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Sigma公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和MTT試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;阿霉素購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司;p-ERK1/2、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer drug resistance protein,BCRP)和肺耐藥蛋白(pulmonary resistance protein,LRP)抗體購自美國Abcam公司;倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;多功能酶標(biāo)儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。含0.5 nmol/mL濃度 ADM的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2/ADM細(xì)胞,維持細(xì)胞的耐藥性,實驗前一周改用不含ADM的培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換一次培養(yǎng)基,每2天傳代1次,取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.4 苦參素對HepG2/ADM細(xì)胞存活率的影響

胰蛋白酶消化細(xì)胞,制成密度為1×104個/mL的單細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔200 μL,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長后,隨機(jī)分為空白組(只加入完全培養(yǎng)基,不接種細(xì)胞),不同濃度苦參素組(5 、10、20、40和60 μg/mL)以及對照組(接種細(xì)胞,不加入苦參素),培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液15 μL,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加入二甲基亞砜150 μL,37 ℃搖床上孵育震蕩10 min,置于酶標(biāo)儀上測定492 nm波長處吸光度(A)值,計算細(xì)胞存活率率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.5 HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性檢測

取第3代對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞和HepG2/ADM細(xì)胞,不同濃度阿霉素(1.5、3、6、12和24 μg/mL)處理24 h,根據(jù)1.4的方法測定吸光度(A)值,計算細(xì)胞抑制率(%)=[(對照組A值-實驗組A值)/(對照組A值-空白組A值)],計算阿霉素半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。為檢測苦參素對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用,采用10 μg/mL苦參素+不同濃度(1.5、3、6、12和24 μg/mL)阿霉素處理HepG2/ADM細(xì)胞,計算苦參素逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/苦參素干預(yù)后耐藥細(xì)胞IC50。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

將HepG2/ADM細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、苦參素組、阿霉素組、苦參素+阿霉素組,苦參素組細(xì)胞用10 μg/mL苦參素處理,阿霉素組細(xì)胞用15 μg/mL阿霉素處理,苦參素+阿霉素組細(xì)胞用10 μg/mL 苦參素和15 μg/mL阿霉素處理,對照組不用任何藥物處理,培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞。在鋪滿基質(zhì)膠的Transwell上室中加入200 μL含5000個細(xì)胞的細(xì)胞懸液,下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,多聚甲醛固定10 min,1%結(jié)晶紫染色10 min,預(yù)冷PBS清洗3次,顯微鏡下拍照并計數(shù)。檢測細(xì)胞遷移能力時Transwell小室上室中不加入基質(zhì)膠,其余操作同上。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

按照1.6的方法處理細(xì)胞,24 h后,收集細(xì)胞,加入500 μL結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸,再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶,充分混勻,避光孵育20 min,上樣,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量

按照1.6的方法處理細(xì)胞,24 h后,裂解液裂解,離心收集上清液,按照BCA試劑盒說明書測定蛋白樣品濃度。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,每個上樣孔加入蛋白樣品50 μg,電泳結(jié)束后,將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,室溫封閉,GAPDH、p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,ECL法顯色,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參素對細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率隨苦參素濃度的升高逐漸降低(P<0.05)。為滿足后續(xù)實驗所需細(xì)胞量,本實驗選用細(xì)胞存活率接近80%的苦參素濃度10 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗,見表1。

表1 不同濃度苦參素對細(xì)胞存活率的影響

2.2 耐藥細(xì)胞的耐藥性及苦參素逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

阿霉素作用于HepG2細(xì)胞和HepG2/ADM細(xì)胞后,兩種細(xì)胞的IC50分別是(4.04±0.63)μg/mL、(19.27±1.69)μg/mL,耐藥指數(shù)為4.77。阿霉素單獨(dú)處理HepG2/ADM細(xì)胞和苦參素聯(lián)合阿霉素處理HepG2/ADM細(xì)胞的IC50分別為(18.66±0.84)μg/mL、(7.25±0.37)μg/mL,苦參素逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.57。

2.3 細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果

與對照組比較,苦參素組和阿霉素組遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);與苦參素組和阿霉素組比較,苦參素+阿霉素組遷移細(xì)胞數(shù)均減少(P<0.05),見表2,圖1。

圖1 結(jié)晶紫染色檢測遷移細(xì)胞數(shù)(×200)

表2 各組細(xì)胞遷移能力比較

2.4 細(xì)胞侵襲能力檢測結(jié)果

與對照組比較,苦參素組和阿霉素組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);與苦參素組和阿霉素組比較,苦參素+阿霉素組侵襲細(xì)胞數(shù)均減少(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 結(jié)晶紫染色檢測侵襲細(xì)胞數(shù)(×200)

表3 各組細(xì)胞侵襲能力比較

2.5 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果

與對照組比較,苦參素組和阿霉素組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與苦參素組和阿霉素組比較,苦參素+阿霉素組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4,圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.6 蛋白印跡法檢測結(jié)果

與對照組比較,苦參素組p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05);與阿霉素組比較,苦參素+阿霉素組p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。對照組和阿霉素組各蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5,圖4。

圖4 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)Western blot圖

表5 各組細(xì)胞中p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

腫瘤多藥耐藥性(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時,對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象,MDR是惡性腫瘤治療失敗的重要原因之一[6],嚴(yán)重制約患者的化療效果和預(yù)后,因此探討腫瘤耐藥的具體機(jī)制、尋找新的治療策略對逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥性具有重要意義。

多項研究表明,苦參素具有逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤耐藥性的作用。Liang等[7]研究表明苦參素通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)5-氟尿嘧啶耐藥性?？鄥⑺赝ㄟ^降低程序性細(xì)胞死亡1蛋白表達(dá)可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對順鉑的耐藥性[8]。由此可見,苦參素對化療耐藥的肝癌細(xì)胞具有一定的作用。本研究通過MTT法檢測不同濃度苦參素對HepG2/ADM細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示:細(xì)胞存活率隨苦參素濃度的升高而降低?？梢?苦參素對HepG2/ADM細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用。阿霉素是臨床上常用的化療藥物,本研究用不同濃度阿霉素處理親本細(xì)胞HepG2和耐藥細(xì)胞HepG2/ADM,發(fā)現(xiàn)HepG2/ADM細(xì)胞出現(xiàn)明顯耐藥性。通過苦參素聯(lián)合不同濃度阿霉素處理HepG2/ADM細(xì)胞發(fā)現(xiàn),苦參素明顯逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性。此外,通過檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力以及細(xì)胞凋亡率,我們發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用苦參素或阿霉素可升高細(xì)胞凋亡率,降低細(xì)胞遷移和侵襲能力,而聯(lián)合使用苦參素和阿霉素作用效果更為顯著。以上結(jié)果表明:苦參素不僅具有抑制HepG2/ADM細(xì)胞增殖的作用,而且可逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。

MAPK是一組信號通路,其中包括ERK信號通路、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)以及c-Jun NH2末端激酶(JNK),在細(xì)胞增殖分化和生長中起著重要調(diào)節(jié)作用。MAPK/ERK信號通路不僅能促進(jìn)加速細(xì)胞周期所需基因的積累,而且可調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞增殖的基因表達(dá),因此該信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Ding等[9]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)H19可能通過阻斷MAPK/ERK信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激并逆轉(zhuǎn)CD133陽性腫瘤干細(xì)胞化療耐藥。Ke等[10]研究表明敲除砷抗性蛋白2通過抑制MAPK/ERK通路可降低人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活性。長鏈非編碼RNA0006528通過激活MAPK/ERK信號通路促進(jìn)人乳腺癌進(jìn)展[11]。本研究蛋白印跡法顯示:阿霉素和苦參素均可降低p-ERK1/2表達(dá),且兩者聯(lián)合作用效果更顯著。

P-gp是多藥耐藥基因編碼產(chǎn)物,主要存在于細(xì)胞膜上,其能夠?qū)⑦M(jìn)入腫瘤細(xì)胞的化療藥物主動泵出,減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物,從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。BCRP是一種新型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,同樣具有將化療藥物泵出腫瘤細(xì)胞的作用。LRP是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白,它不僅可以阻止某些以細(xì)胞核為效應(yīng)點的藥物通過核膜孔進(jìn)入細(xì)胞核,而且可以將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至運(yùn)輸囊泡中,從而隔絕藥物發(fā)揮作用[12-13]。人肝癌細(xì)胞HepG2/ADM中LRP和BCRP表達(dá)升高,美洲大蠊提取物可降低LRP和BCRP表達(dá),逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的耐藥性[14]。本研究中苦參素可降低HepG2/ADM中LRP、P-pg以及BCRP蛋白表達(dá),說明苦參素可逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性。

綜上所述,苦參素對肝癌耐藥HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性具有一定逆轉(zhuǎn)作用,而且可降低耐藥細(xì)胞遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其可能是通過抑制ERK/MAPK信號通路發(fā)揮作用。為臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。