針刺太沖穴對肝陽上亢型偏頭痛大鼠血清血管活性物質(zhì)含量的影響

林淑芳 王嘉駒 陳 白 曹麗萍 姚娟娟 江一靜

(1 福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院,福州,350003; 2 福建省康復技術重點實驗室,福州,350003; 3 蘭州大學,蘭州,730000)

偏頭痛是一種反復發(fā)作的可致殘的神經(jīng)血管性疾病,全球超過10億人受偏頭痛困擾[1],發(fā)作時劇烈的搏動性疼痛,伴隨畏光、惡心及嘔吐等癥狀嚴重影響患者的日常生活[2]。目前臨床所用藥物雖然能減少偏頭痛的發(fā)作頻率,但伴隨著睡眠障礙、代謝紊亂或肝臟損害等不良反應[3],與藥物比較,針刺能有效、安全地預防和治療偏頭痛[4],緩解疼痛[5],改善大腦功能[6]。降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)、5-羥色胺(5-hydroxy Tryptamine,5-HT)及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)等神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)參與了偏頭痛的病理生理過程;CGRP是偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展過程中重要的血管活性肽之一,參與痛覺信息傳遞、外周和中樞敏化,有強烈的舒血管作用,可產(chǎn)生搏動性疼痛[7];5-HT是單胺類小分子神經(jīng)遞質(zhì),參與偏頭痛的痛覺調(diào)制,當5-HT神經(jīng)元活動增強時,痛閾升高,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[8];TNF-α是一種炎癥介質(zhì),并且有神經(jīng)遞質(zhì)效應,參與偏頭痛神經(jīng)源性炎癥反應[9]。肝陽上亢證在偏頭痛的證候分型中最常見[10],本課題組前期觀察證實針刺雙側(cè)太沖穴可明顯改善肝陽上亢偏頭痛患者疼痛情況和生命質(zhì)量[11],但其機制尚不明確。因此,本研究以肝陽上亢偏頭痛大鼠為研究對象,觀察針刺雙側(cè)太沖穴對偏頭痛大鼠血清CGRP、5-HT及TNF-α含量的影響,為臨床針刺太沖穴治療肝陽上亢型偏頭痛提供機制研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,購自浙江省醫(yī)學科學院[許可證號:SCXK(浙)2018-0004],在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物房喂養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定于22 ℃,濕度恒定于50%,光暗周期為12 h,自由攝食、飲水。整個實驗過程中參考《關于善待實驗動物的指導性意見》[12]為處理動物的參考,符合實驗動物倫理學原則,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準同意(倫理審批號:FJTCM IACUC 2022054)。

1.1.2 儀器與試劑 華佗牌一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,0.25 mm×13 mm,批號:200135),高速冷凍離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5810R),自動平衡離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5430R),全自動酶標儀(Bio-Tek公司,美國,型號:Elx800),恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司,型號:HWS24);硝酸甘油注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號:1210901),CGRP試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F15261),5-HT試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F16771),TNF-α試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F15710)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應性喂養(yǎng)1周后,將50只SD大鼠隨機分為空白對照組(n=10)、模型組(n=40),模型組大鼠以附子湯灌胃結(jié)合頸肩部皮下注射硝酸甘油建立肝陽上亢偏頭痛模型,其中30只大鼠成模,將成模的大鼠隨機分為模型組、太沖組、非穴組,每組10只。本研究以附子湯灌胃結(jié)合注射硝酸甘油方法復制肝陽上亢偏頭痛模型[13-14]。將20 g制附子浸泡30 min,煎煮2次后將藥液混合,濃縮為含生藥0.1 g/mL的附子濃縮液,以20 mL/(kg·d)的劑量連續(xù)灌胃21 d,當大鼠出現(xiàn)眼結(jié)膜顏色變紅,抓尾時尖叫、驚跳甚至咬人等易激惹表現(xiàn)時提示肝陽上亢模型復制成功;再用0.9% NaCl硝酸甘油注射液稀釋成濃度為2 mg/mL溶液,以10 mg/kg算出每只SD大鼠所需注射的劑量,用5 mL注射器抽取相對應劑量溶液,在大鼠右肩頸部皮下緩緩注射,1次/d,共5 d;注射硝酸甘油后,SD大鼠出現(xiàn)耳紅,爬籠以及前肢撓頭連續(xù)超過5次以上等煩躁不安次數(shù)增加的癥狀,為偏頭痛模型制作成功。

1.2.2 干預方法 空白對照組:普通籠中飼養(yǎng),每次抓取后無任何治療。模型組:建模成功后普通籠中飼養(yǎng),每次抓取后無任何治療。太沖組:行為學觀察1 h后,針刺雙側(cè)太沖穴(定位參考實驗大鼠腧穴圖譜[15]),用0.25 mm×13 mm的一次性無菌針灸針直刺2～3 mm,捻轉(zhuǎn)瀉法1 min,每10 min行針1次,留針30 min。非穴組:行為學觀察1 h后,針刺雙側(cè)肋下固定非穴點(雙側(cè)髂嵴直上10 mm處),約30°斜刺2～3 mm,行針手法同太沖組。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學 觀察偏頭痛大鼠耳紅持續(xù)時間及針刺前后撓頭和爬籠次數(shù):觀察造模后大鼠耳紅出現(xiàn)直至消失的持續(xù)時間;在針刺前、針刺后1 h、針刺后2 h共3個時間段分別記錄撓頭、爬籠次數(shù),針刺治療期間不記次。

1.2.3.2 血清CGRP、5-HT、TNF-α的含量 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測偏頭痛大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α的含量:行為學觀察完畢后,檢測血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量。經(jīng)腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主動脈采血約1 mL放入預冷的試管,加入10%乙二胺四乙酸鈉15 μL混勻,在高速冷凍離心機中以12 000×g,離心15 min,分離血漿后取上層血清分裝于凍存管,置于-80 ℃冰箱保存待測。按ELISA試劑盒說明書稀釋標準品,每孔加樣品50 μL(空白孔不添加標準品和待測樣品),在設定37 ℃恒溫箱中溫育30 min;配液后每孔反復加入洗滌液并拍干,反復5次;每孔加入50 μL酶標試劑(空白孔不添加),再次在設定37 ℃恒溫箱中溫育30 min;洗滌后顯色,分別加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL,在避光37 ℃環(huán)境中反應15 min,每孔加入終止液50 μL終止后測定,選取波長為450 nm,將待測品放入酶標儀檢測,根據(jù)標準品的濃度及測得的吸光度(A)值計算出對應的樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠造模后行為學觀察 空白對照組無耳紅,模型組、太沖組及非穴組均在注射硝酸甘油后4 min左右出現(xiàn)耳紅,3 h左右后消失;與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠耳紅持續(xù)時間明顯較短(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后耳紅出現(xiàn)時間和消失時間比較

空白對照組在各時間段內(nèi)偶爾出現(xiàn)幾次撓頭、爬籠。針刺前,與空白對照組比較,模型組、太沖組及非穴組大鼠撓頭、爬籠次數(shù)明顯增多(P<0.05);模型組、太沖組、非穴組之間撓頭及爬籠次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺干預后1 h、2 h,與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠撓頭、爬籠次數(shù)均明顯減少(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量比較 與空白對照組比較,模型組大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明顯增高(P<0.05),5-HT含量明顯降低(P<0.05);與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明顯減少(均P<0.05),5-HT含量明顯增多(均P<0.05)。見表2,圖2。

圖2 各組大鼠治療后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比較注:與空白對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與非穴組比較,▲P<0.05

表2 各組大鼠治療后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比較

3 討論

偏頭痛屬中醫(yī)學“偏頭風”“頭風”等病癥范疇。偏頭痛與肝關系密切,多從肝論治[16];文獻分析證實,在偏頭痛的辨證分型中,肝陽上亢證最為常見[10],肝氣主升,體陰而用陽,肝陽偏亢生發(fā)太過,陰不制陽,導致偏頭痛,宜平肝通絡止痛?！皻庥杏嘤谏险?導而下之”,太沖穴可平肝潛陽,疏調(diào)氣血運行,且為肝經(jīng)輸穴主疼痛,緩解偏頭痛臨床癥狀[11,17]。太沖穴分布有腓淺神經(jīng)、皮神經(jīng)、趾背動靜脈及足背靜脈網(wǎng),且在大腦皮質(zhì)功能投影范圍較廣,可調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)功能[18]。研究發(fā)現(xiàn),針刺太沖穴可迅速顯著地調(diào)節(jié)偏頭痛患者的腦血流量,這是太沖穴作為肝陽上亢偏頭痛最常用的遠端取穴的原因之一[19]。三叉神經(jīng)血管學說是偏頭痛發(fā)病機制研究的主要學說之一,該學說認為偏頭痛發(fā)作產(chǎn)生的神經(jīng)源性炎癥反應與CGRP、5-HT、TNF-α等血管活性物質(zhì)密切相關[20-21]。課題組前期研究已證實針刺雙側(cè)太沖穴對肝陽上亢偏頭痛的臨床療效,因此,本研究從血管活性物質(zhì)角度探討針刺太沖穴治療肝陽上亢偏頭痛的作用機制。

CGRP是重要的血管活性神經(jīng)肽,是三叉神經(jīng)血管反射學說中引起神經(jīng)源性炎癥反應的重要舒血管物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),偏頭痛患者發(fā)作期血清CGRP水平明顯高于正常人[22];臨床和實驗研究證實靜脈或腹腔注射CGRP會誘發(fā)偏頭痛發(fā)作[23-24],而降低外周血CGRP活性可抑制三叉神經(jīng)敏化,有效緩解偏頭痛發(fā)作[25];臨床研究發(fā)現(xiàn)針刺可降低偏頭痛患者血清中CGRP水平[26],本研究再次證實這一結(jié)論。本研究中,針刺前大鼠血清中CGRP含量升高,針刺太沖穴后與針刺非穴比較,針刺太沖穴的大鼠血清CGRP含量明顯降低,說明針刺太沖穴可通過減少血清CGRP含量緩解偏頭痛。有學者在太沖穴區(qū)的顯微結(jié)構中發(fā)現(xiàn)穴區(qū)內(nèi)細小血管與CGRP陽性神經(jīng)纖維相伴行,這或許是針刺太沖穴起效的物質(zhì)基礎之一[27]。

5-HT通過與不同受體結(jié)合介導腦膜血管舒縮、神經(jīng)源性炎癥反應、痛覺信息傳遞等途徑調(diào)制痛覺,對偏頭痛有雙向的影響[28]。臨床研究發(fā)現(xiàn),針刺通過提高偏頭痛患者血清中5-HT含量參與鎮(zhèn)痛過程[29];針刺使5-HT受體高表達,激活5-HT,從而抑制CGRP的釋放,治療偏頭痛[30]。本研究顯示,偏頭痛模型大鼠血清5-HT較正常大鼠明顯偏低,針刺太沖后血清5-HT明顯上升,這與上述研究結(jié)果一致,可見,提高偏頭痛血清5-HT含量是針刺太沖穴起鎮(zhèn)痛作用的途徑之一。

炎癥介質(zhì)TNF-α參與偏頭痛神經(jīng)源性炎癥反應過程,三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元釋放的CGRP可促進衛(wèi)星細胞釋放TNF-α,而TNF-α可反作用于大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元進一步促進CGRP分泌和表達[31]。有研究報道,TNF-α在偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)顯著表達[32],而TNF-α抑制劑能明顯減輕神經(jīng)病理性疼痛[33],認為TNF-α可能是偏頭痛治療的潛在靶點。本研究顯示,偏頭痛模型大鼠血清TNF-α含量明顯升高,這與另一研究結(jié)果相符[34];與針刺非穴比較,針刺太沖穴可顯著降低血清TNF-α含量,針刺太沖穴治療偏頭痛具有穴位特異性。

綜上所述,針刺雙側(cè)太沖穴可通過降低血清CGRP、TNF-α含量,提高血清5-HT含量治療肝陽上亢偏頭痛。針刺太沖穴可能通過調(diào)節(jié)外周血相關血管活性物質(zhì)參與偏頭痛,以此為基礎,本課題組將進一步深入研究針刺太沖穴對偏頭痛三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的中樞調(diào)控機制。

利益沖突聲明:無。