麥魚線粒體基因組序列測定與結構特征分析

鮑鳴　奚業(yè)文　海思嬈　王晨龍　陳闖將　王希春　李西雷

摘 要：通過PCR擴增和一代測序技術獲得麥魚 （Rhinogobius sp.） 線粒體基因組全序列，并對其序列結構進行了分析。結果表明：1） 麥魚線粒體基因組全長16 511 bp，其堿基G+C的含量為47.7%，A+T的含量為52.3%，呈現(xiàn)AT偏好性；2） 共含有蛋白質編碼基因13個，rRNA基因2個，tRNA基因22個和D-loop區(qū)，除ND6、tRNA-Gln、tRNA-Tyr、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Ser、tRNA-Glu、tRNA-Pro基因在L鏈上編碼之外，其他基因均在H鏈上進行編碼；3） 基于線粒體基因組全序列和Cytb基因，分別構建了鰕虎魚類中部分屬的進化樹，其表明麥魚與波氏吻鰕虎魚、褐吻鰕虎魚、子陵吻鰕虎魚聚在一個分支上，均屬于吻鰕虎魚屬，并且其與波氏吻鰕虎魚的親緣關系最近。

關鍵詞：麥魚（Rhinogobius sp.）；線粒體基因組；序列分析；系統(tǒng)發(fā)育進化；物種鑒定

麥魚（Rhinogobius sp.） 屬鱸形目（Perciformes），鰕虎魚亞目（Gobioidei），鰕虎魚科（Gobiidae），吻鰕虎魚屬（Rhinogobius），為安徽省池州市東至縣所特有的小型魚類之一，因盛產(chǎn)于刈麥季節(jié)而定名，與著名的廬山石魚屬于同一種類[1]。迄今對于麥魚的研究甚少，麥魚準確的物種鑒定、分類地位及遺傳多樣性尚未確定，現(xiàn)僅有根據(jù)形態(tài)學特征進行的分類研究，其養(yǎng)殖潛力尚待評估與開發(fā)[1]。

線粒體基因組數(shù)據(jù)特點顯著，如結構緊密、能夠自主復制、編碼效率高、無組織特異性、無重組現(xiàn)象、進化速率快以及遵循嚴格的母系遺傳等，在系統(tǒng)與進化生物學和群體遺傳學等許多生物學研究中已廣泛應用[2-9]。目前對鰕虎魚科多屬種的分類較為混亂，當前最被接受的分類是NELSON（2006）提出的9科5亞科分類方法，中國鰕虎魚分類與此一致[10-11]。根據(jù)分布范圍已經(jīng)證實過去記載于我國的櫛鰕虎魚屬種類實際上應歸為吻鰕虎魚屬[12]。在已有的研究中，研究者根據(jù)形態(tài)特點結合生態(tài)習性將麥魚鑒定為吻鰕虎魚和洞庭吻鰕虎魚[1]，伍漢霖等[13]、劉蟬馨[14]、羅智等[15]根據(jù)生物及生態(tài)學特性研究鰕虎魚類的分類地位。曲麗艷[10]通過核基因及線粒體COI基因對28種鰕虎魚進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將傳統(tǒng)分類中歸為鰕虎魚亞科的睛尾蝌蚪鰕虎魚聚到小鰕虎亞科，其他大部分結果與形態(tài)研究一致。ZHONG等[16]通過線粒體基因對波氏吻鰕虎魚（Rhinogobius Cliffordpopei）進行的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，波氏吻鰕虎魚與其他吻鰕虎魚屬魚類聚在一個分支，但吻鰕虎魚屬與縞鰕虎魚屬的進化關系尚不清楚。

本試驗使用PCR擴增和一代測序技術，測定了麥魚的線粒體基因組全序列，分析了基因的排序及其組成，通過與26種鰕虎魚類線粒體基因組進行比對，構建鰕虎魚類的系統(tǒng)進化樹，進一步鑒定了麥魚的分類地位，補充了鰕虎魚科的線粒體基因組數(shù)據(jù)，也為吻鰕虎魚屬的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了參考基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中所用的麥魚樣品均由2022年7月采自安徽省池州市東至縣。采集樣本的肌肉組織以及肝臟組織，去離子水清洗，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 線粒體DNA提取

使用滅菌的剪刀切割30 g左右的肌肉組織于液氮中，-80 ℃保存待用，線粒體DNA嚴格按照上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司細胞線粒體DNA抽提試劑盒說明書進行，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 線粒體基因組測序

引物設計根據(jù)麥魚種在NCBI上的近緣物種的線粒體基因序列，PCR擴增程序為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min/kb，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，DNA純化樣品直接測序。

1.4 序列的拼接與分析

使用BioEdit進行序列分析，刪去可信度低的測序片段，并統(tǒng)計其長度，再利用NCBI在線功能BLAST與數(shù)據(jù)庫里面已經(jīng)報道過的鰕虎魚亞科進行比對分析，并使用Contig Express進行序列的拼接，最終補全序列，將麥魚全線粒體基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號為QDA22533.1—QDA22545.1。

使用NCBI在線分析Open Reading Frame Finder預測確定編碼位置。用NCBI中已有的鰕虎魚類線粒體基因組進行比對，注釋蛋白質編碼基因（Protein coding genes，PCGs）及D-Loop區(qū)。軟件MEGA7.0分析線粒體基因序列的堿基組成、密碼子使用情況以及堿基偏移程度。

利用在線tRNAscan-SE軟件進行麥魚tRNA基因定位，并利用The Mfold Web Server 在線軟件有效預測麥魚線粒體tRNA的二級結構。

1.5 系統(tǒng)進化樹的構建

使用 MEGA 7.0基于K-2-P模型采用自展法（bootstrap）1 000次檢驗分支可信度，構建鄰接法（NJ法）分子系統(tǒng)進化樹，將在GeneBank中下載的同一屬26種鰕虎魚類的線粒體基因組全序列以及Cytb基因序列與本試驗得到的麥魚線粒體基因組全序列（16 511 bp）進行多重序列比對和分析，以了解鰕虎魚類之間的發(fā)育關系。使用的基因基本信息見表1。

2 結果與分析

2.1 麥魚線粒體基因組結構與特征

麥魚線粒體基因組全長16 511 bp，堿基含量分別為A （26.7%） 、T （25.6%） 、G （16.9%） 、C （30.8%） ；G+C含量為47.7%，A+T含量為52.3%，說明本試驗中麥魚線粒體基因組呈現(xiàn)AT偏好性。麥魚線粒體全基因組序列中共含37個基因，分別為PCGs 13個、tRNA基因22個、rRNA基因2個和d-loop區(qū) 1個（見封三圖1）。ND6基因以及tRNA基因中的tRNA-Gln、tRNA-Tyr、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Ser、tRNA-Glu和tRNA-Pro均在L-鏈上進行編碼，余下的28個蛋白質基因及tRNA基因則均在H-鏈上進行編碼（表2） 。

麥魚線粒體基因組結構與眾多魚類基因組結構相同，堿基排列較緊密，但仍存在部分重疊與間隔[3-5]。其基因間隔共有11處，間隔長度共計58 bp，其中間隔最大處出現(xiàn)于tRNA-Cys基因與tRNA-Asn基因之間，間隔為32 bp。而基因重疊共計出現(xiàn)6次，共計21 bp，長度不一，其中重疊長度最多的一處出現(xiàn)在ATP8與ATP6之間以及ND4L基因與ND4基因之間，重疊7 bp。既沒有出現(xiàn)重疊也沒有出現(xiàn)間隔處總計22處 （表2） 。

2.2 線粒體基因組蛋白質編碼基因

本次試驗獲得的麥魚線粒體基因組的13個蛋白質編碼基因序列總長度為11 428 bp，含3 810個密碼子 （終止密碼子除外） ，在H鏈上進行編碼的有12個基因（ND1，ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5、Cytb） ，僅ND6基因在L鏈上進行編碼。蛋白質編碼基因擁有兩種起始密碼子（ATG和GTG），除了COX1蛋白質編碼基因的起始密碼子為GTG以外，其余12個蛋白質編碼基因的起始密碼子均為ATG。終止密碼子有四種（TAG、TAA、TA-、T--），使用情況相較起始密碼子更為復雜。其中ND1、COX1、ATP8、ND4L、ND5基因的終止密碼子為TAA；ND2、ND6基因的終止密碼子為TAG；而COX2、COX3、ND3、ND4、Cytb基因則是以不完全的T作為終止密碼子；ATP6基因的終止密碼子為TA-。終止密碼子使用情況與太平洋鱈[3]、黃條鰤[4]相同。

軟件分析蛋白質編碼基因密碼子的使用頻率（表3）以及同義密碼子使用頻率的結果表明：13個蛋白質編碼基因中有35個偏好密碼子（RSCU密碼子），第三位為C或T的密碼子具有很高的使用頻率，以G為結尾的密碼子使用頻率最小。第三位堿基以A或者T結尾的密碼子中，UUA（L）、UCA（S）、UAU（Y）、CAU（H）、AAU（N）、GAU（D）、UGU（C）、CGU（R）、AGU（S）、GGU（G）、GGA（G）密碼子的RSCU小于1，其他密碼子RSCU均大于1。

2.3 線粒體基因組tRNA基因及rRNA基因

麥魚線粒體基因組共計22個tRNA基因，其長度分布于68 bp到76 bp之間，總計1 556 bp，不均勻地分布于13個蛋白質編碼基因之間。分析結果顯示，tRNA基因之間存在著相同程度的重疊及不同程度的間隔，tRNA-Ile與tRNA-Gln、tRNA-Thr與tRNA-Pro、tRNA-Gln與tRNA-Met分別都存在相同程度的核苷酸重疊，三組重疊的核苷酸都是1bp。其間隔的長度從1 bp至32 bp不等，如tRNA-Asn基因與tRNA-Cys基因之間的間隔為32 bp。tRNA-Gln、tRNA-Asn、tRNA-Ala、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Glu、tRNA-Ser、tRNA-Pro基因均在L鏈進行編碼，其余14個tRNA基因在H鏈編碼。tRNA的二級結構預測結果顯示（詳見圖2），tRNA-Val、tRNA-Phe等21個tRNA基因均可形成明顯的三葉草結構，tRNA-Ser （GCT） 基因缺失二氫尿嘧啶臂 （DHU臂） 。

另外，麥魚線粒體基因組包括rRNA基因2個，12S rRNA以及16S rRNA基因，均處于H鏈上，位于tRNA-Phe與tRNA-Leu之間，由tRNA-Val基因將兩者分開。12S rRNA基因和16S rRNA基因的A+T含量分別為52.8%和52.7%，呈現(xiàn)AT堿基偏好性。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

2.4.1 線粒體全基因組NJ進化樹分析 系統(tǒng)進化樹（見圖3）分為兩個大支，第一個分支由大彈涂魚屬、青彈涂魚屬、副平牙鰕虎魚屬、狼牙鰕虎魚屬 、鰻鰕虎魚屬、齒彈涂魚屬、彈涂魚屬、縞鰕虎魚屬、竿鰕虎魚屬、鯔鰕虎魚屬等構成；第二個分支由尖塘鱧屬、烏塘鱧屬、吻鰕虎魚屬構成。

由圖3可知本次試驗獲得的麥魚線粒體基因組和子陵吻鰕虎魚、褐吻鰕虎魚、波氏吻鰕虎魚聚在較近的分支上，與波氏吻鰕虎魚親緣關系最近。并進一步證實過去記載于我國的櫛鰕虎魚屬種類實際上應歸為吻鰕虎魚屬，結果與前人的分類結果相契合[17]。

2.4.2 Cytb基因NJ進化樹分析 本分析采用當前在物種鑒別、遺傳多樣性和群體分化中常用的Cytb基因作為分子標記，研究麥魚的系統(tǒng)發(fā)育地位[3，18-20]。該系統(tǒng)進化樹（見封三圖4） 主要分為三個分支，青彈涂魚屬、副平牙鰕虎魚屬、狼鰕虎魚屬、齒彈涂魚屬和彈涂魚屬聚為一個大支，縞鰕虎魚屬為一個分支，吻鰕虎魚屬、烏塘鱧屬、竿鰕虎魚屬、尖塘鱧屬和鯔鰕虎魚屬聚為一個分支，烏塘鱧屬與吻鰕虎魚屬和本次研究的麥魚距離最近，由圖4可知，根據(jù)Cytb基因構建的進化樹與線粒體全基因組構建的進化樹結果幾乎完全一致。

3 討論

通過研究獲得麥魚線粒體基因組全長16 511 bp，包括22個tRNA 基因、13個蛋白編碼基因，2個rRNA 和1段 D-loop 控制區(qū)，在玻璃缺鰭鯰（Kryptopterus vitreolus）[5]中也有此類結構。其線粒體基因組中，A+T堿基 （52.3%） 大于G+C堿基 （47.7%） 含量，呈現(xiàn)AT偏好性，這與太平洋鱈 （Gadus macrocephalus）[3]、黃條鰤（Seriola aureovittata）[4]、玻璃缺鰭鯰[5]、吻鰕虎魚屬（Rhinogobius）[21]等魚類相似。

在麥魚線粒體基因組中，蛋白質編碼基因既存在于H鏈也存在于L鏈上。Brown等[6]報道，H鏈上的蛋白質編碼基因不容易形成有保護的雙鏈，因該H鏈大多是水解的單鏈。與黃條鰤[4]相似，麥魚線粒體基因組中絕大多數(shù)蛋白質編碼基因都位于H鏈上，易于發(fā)生相應的水解和氧化，而位于L鏈上的ND6基因會穩(wěn)定很多，這也體現(xiàn)了ND6基因的差異性和重要性。

在麥魚mtDNA的tRNA基因和rRNA基因中，含有22個tRNA，它們的長度分布于68 bp到76 bp之間，總計1 556 bp，其中絕大部分tRNA的二級結構都滿足三葉草的形狀，穿插于不同的蛋白質編碼基因與rRNA中間。僅tRNA-Ser （GCT） 基因缺失二氫尿嘧啶臂 （DHU臂），這與毛明光等[3]研究的太平洋鱈十分相似。麥魚線粒體基因組中含有2個rRNA，16S rRNA和12S rRNA，其與相鄰基因并無間隔和重疊。線粒體基因組中含有的重復序列、部分插入序列和序列等都屬于物種進化的特征[7]。

本研究的麥魚與波氏吻鰕虎魚、褐吻鰕虎魚、子陵吻鰕虎魚聚在一個分支上，均屬于吻鰕虎魚屬，并且其與波氏吻鰕虎魚的親緣關系最近。此外，吻鰕虎魚屬與中華烏塘鱧、尖塘鱧、斑駁尖塘鱧所聚成的塘鱧屬比較接近，這與曲麗艷[10]、孫希福[18]、金逍逍等[22]、ZHONG等[16]等的分析結果基本相似。本次試驗的麥魚不管是線粒體基因組全序列進化樹，還是使用Cytb基因構建的進化樹分析，都出現(xiàn)了烏塘鱧屬、吻鰕虎魚屬與麥魚的距離最近的結果，但是對于其他分析結果有所不同，縞鰕虎魚屬在線粒體基因組分析中和其他屬歸為一支，在使用Cytb基因進行進化樹分析時，單獨地劃為一個分支。產(chǎn)生這樣的結果是因為脊椎動物線粒體基因的不同區(qū)域的進化速率不同，所以線粒體各個基因的系統(tǒng)發(fā)育信息的表現(xiàn)也會有所不同。

目前，線粒體基因組中的相關基因被大量應用于系統(tǒng)發(fā)育、物種分類等相關研究領域[2]。KIM等[23]、黃小林等[8]基于mtDNA中的12S rRNA、ND4L基因構建系統(tǒng)進化樹研究矛尾刺鰕虎魚（Acanthogobius hasta）、籃子魚（Siganidae Siganus）的進化地位。隨著分子生物學手段的普遍使用，國內外學者對鰕虎魚科魚類系統(tǒng)發(fā)育研究也越來越多，AGORRETA等[24]分析了222種歐洲的鰕虎魚目魚類在系統(tǒng)進化上的關系，THACKER等證實了絲鰭鱚屬是鰕虎魚科的姐妹屬[25]，研究了鰕虎魚科在棘鰭魚目中的系統(tǒng)分布[26]。普遍來說線粒體基因的進化速度大于物種的進化速度，不同的地理環(huán)境、生活習慣也都有機會導致物種DNA的變異，要解釋清楚還需要進一步加深對于線粒體基因的研究。

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The analysis of complete mitochondrial genome sequences and gene organization of Rhinogobius sp.（Perciformes，Gobiidae）

BAO Ming1，XI Yewen1，HAI Sirao2，WANG Chenlong2，CHEN Chuangjiang2，WANG Xichun2，LI Xilei2

（1.Aquatic Technology Promotion Station of Anhui，Hefei 230601，China;2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Abstract：The PCR and the first-generation sequencing technology were used to obtain the complete mitochondrial genome （mtDNA） sequences of Rhinogobius sp..The mtDNA was annotated and its structure was analyzed.In present study，the circular genome was 16 511 bp in length.The G+C content was 47.7% and the A+T content was 52.3%，which showed a tendency of high AT.The mitochondrial genome encodes 13 proteins and 2 rRNAs，22tRNAs and a D-Loop region.Except for ND6，tRNA-Gln，tRNA-Tyr，tRNA-Ala，tRNA-Asn，tRNA-Cys， tRNA-Ser，tRNA-Glu，tRNA-Pro，all the other genes were encoded on the heavy strand （H strand） .Based on the whole mitochondrial genome sequence and the Cytb gene，the pthlogenetic trees were constructed separately with several species in Gobiidae.It showed that Rhinogobius sp.clustered with R. cliffordpopei，R.brunneus and R.giurinus on a branch，belonging to Rhinogobius and having the closest relationship with R. cliffordpopei.

Key words：Rhinogobius sp.; mitochondrial genome; sequence analysis; phylogenetic evolution; species identification

（收稿日期：2023-05-17）

作者簡介：鮑鳴（1979.7-），女，研究生，工程師，研究方向：水產(chǎn)品質量安全、漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測等。E-mail： baominglj@126.com。