運(yùn)用OD值對常見畜禽腹瀉病原菌計(jì)數(shù)的研究

王佳 張莉 豆思遠(yuǎn) 高軍軍 李勇生

摘? 要：本研究就畜禽常見腹瀉病原菌的生長特性、細(xì)菌懸液濁度和細(xì)菌計(jì)數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行探討，通過對常見畜禽腹瀉病原菌大腸桿菌（O8型和O139型）、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌和雞傷寒沙門菌不同培養(yǎng)時(shí)間段吸光度（optical density，OD）值的測定，結(jié)合平板活菌計(jì)數(shù)法來確定這5種細(xì)菌的生長曲線，并對細(xì)菌濁度和細(xì)菌計(jì)數(shù)相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)極顯著相關(guān)（P＜0.01），建立了5種細(xì)菌在生長期和穩(wěn)定期的OD值-細(xì)菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程，O8型大腸桿菌：y=2.55x+6.72（r2=0.96）；O139型大腸桿菌：y=1.45x+8.77（r2=0.95）；雞傷寒沙門菌：y=4.50x+7.02（r2=0.95）；鼠傷寒沙門菌：y=5.59x+7.67（r2=0.97）；雞白痢沙門菌：y=9.72x+6.60（r2=0.98）。利用該回歸方程可快速準(zhǔn)確地確定菌液濃度，為探討細(xì)菌的培養(yǎng)特性、致病機(jī)制及動物實(shí)驗(yàn)中攻毒劑量的確定等相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生長曲線；紫外分光光度法；活菌計(jì)數(shù)

中圖分類號：S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號：1001-0769（2023）04-00101-06

在微生物實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)菌毒力的測定和動物攻毒實(shí)驗(yàn)時(shí)，菌液濃度是重要指標(biāo)之一，常需要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌生長的測定方法分為直接法和間接法[1-2]，比較常見的是平板計(jì)數(shù)法和比濁法。平板計(jì)數(shù)法結(jié)果相對準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜且時(shí)間較長；比濁法相對簡單，但結(jié)果易受環(huán)境溫度、培養(yǎng)基色澤等因素的影響，易發(fā)生偶然誤差。研究表明，細(xì)菌懸液的吸光度與其濃度呈正相關(guān)性[3-5]。本研究采用分光光度計(jì)，對大腸桿菌（O8型和O139型）、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞傷寒沙門菌等細(xì)菌懸液進(jìn)行吸光度（optical density，OD）值的測定，結(jié)合平板活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，擬建立一種快速準(zhǔn)確的方法，為動物實(shí)驗(yàn)中攻毒劑量的濃度確定提供科學(xué)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli：O8型和O139型）、雞傷寒沙門菌（Salmonella gallinarum）、雞白痢沙門菌（Salmonella pullorum）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

722s可見分光光度計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司，TD25-WS低速多管架自動平衡離心機(jī)購自長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，麥?zhǔn)媳葷峁埽?.5-5 McFarland）購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，L棒、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉等購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，NaOH購于西安化學(xué)試劑廠，K2HPO4購于成都化學(xué)試劑廠，NaCL購于天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司。

1.3 菌種活化及種子液的培養(yǎng)

試驗(yàn)前將保存的5種菌種接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化，然后接種于無菌新鮮肉湯10 mL中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，將培養(yǎng)物倒入無菌離心管內(nèi)離心10 min（3 000 r/min），用無菌生理鹽水洗滌三次后，將菌種配制成1.8×109 CFU/mL的菌懸液，一般情況下每100 mL培養(yǎng)18 h的大腸桿菌或沙門菌培養(yǎng)液，離心10 min（3 000 r/min）后制成20 mL細(xì)菌懸液，作為種子液，以備擴(kuò)大培養(yǎng)用。

1.4 種子液擴(kuò)大培養(yǎng)

按5％的接種量，將備用種子液接種于200 mL無菌新鮮肉湯中，充分搖勻后置于? 37 ℃培養(yǎng)。從培養(yǎng)起每隔1 h/2 h吸取菌液用分光光度計(jì)測吸光度值，并結(jié)合活菌計(jì)數(shù)法測細(xì)菌濃度，每隔1 h/2 h重復(fù)以上步驟（培養(yǎng)10 h及以前的菌液每隔1 h重復(fù)以上步驟，培養(yǎng)10 h后的菌液每隔2 h重復(fù)以上步驟）。

1.5 吸光度值測定

定時(shí)取樣，用分光光度計(jì)于460 nm/600 nm波長（O8型大腸桿菌和O139型選用460 nm，雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞傷寒沙門菌選用600 nm）測OD值，以無菌肉湯作為對照[6-8]。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)間段OD值為縱坐標(biāo)，作圖，繪制生長曲線。

1.6 活菌計(jì)數(shù)

菌液取樣后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。對培養(yǎng)的各菌液進(jìn)行倍比稀釋（培養(yǎng)0～10 h的菌液取10-2～10-9稀釋度，培養(yǎng)超過10 h的菌液取10-4～10-10稀釋度），分別取100 μL細(xì)菌懸液均勻涂布于直徑90 mm的平板上，每個(gè)稀釋度涂3塊平板。37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后，可見菌落形成，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值作為菌落數(shù)，計(jì)算出菌懸液的濃度（CFU/mL）。以細(xì)菌菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，構(gòu)建生長曲線。

1.7 細(xì)菌濁度與活菌計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析

用統(tǒng)計(jì)方法對5種細(xì)菌的OD值與活菌計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，根據(jù)它們之間是否存在顯著的相關(guān)性，確定是否可以建立數(shù)學(xué)模型定量的描述細(xì)菌濁度和細(xì)菌計(jì)數(shù)的相關(guān)性，從而根據(jù)建立的曲線回歸方程進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的評估，建立OD值-細(xì)菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程[9]。

2? 結(jié)果與分析

在培養(yǎng)條件不變的情況下，定時(shí)取樣測定其在460 nm/600 nm處的OD值（大腸桿菌測定波長采用600 nm，沙門菌的采用460 nm），以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值或細(xì)菌數(shù)對數(shù)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建生長曲線。5條曲線分別包含適應(yīng)期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期[10]。

對5種菌的OD值與細(xì)菌數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明它們均存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），這表明可以通過建立數(shù)學(xué)模型定量描述細(xì)菌濁度和細(xì)菌計(jì)數(shù)的關(guān)系。因此可以根據(jù)建立的5種菌曲線回歸方程來進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的評估。

2.1 O8型大腸桿菌

測定O8型大腸桿菌生長曲線，其初始接種菌懸液濃度為3.7×106 CFU/mL。從圖1可以看出，該菌生長大致分為4個(gè)時(shí)期。其中0～ 1 h為適應(yīng)期，在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，細(xì)菌生長遲緩。2～6 h為對數(shù)期，此時(shí)細(xì)菌數(shù)的對數(shù)值與時(shí)間呈線性關(guān)系，細(xì)菌數(shù)以幾何級數(shù)增加。6～20 h為穩(wěn)定期，細(xì)菌增加和死亡的數(shù)量趨向平衡。20～24 h為衰亡期，表現(xiàn)“負(fù)增長”現(xiàn)象，即細(xì)菌死亡的數(shù)量多于細(xì)菌增加的數(shù)量。

對O8型大腸桿菌OD600 nm值與細(xì)菌數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），在生長期和穩(wěn)定期細(xì)菌菌液的OD值與細(xì)菌數(shù)之間呈顯著相關(guān)性，O8型大腸桿菌的OD值與細(xì)菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=2.55x+6.72（r2=0.96）。該曲線的回歸相關(guān)指數(shù)r2=0.96，說明曲線回歸方程的擬合度比較高（圖2）。

2.2 O139型大腸桿菌

從細(xì)菌生長周期中菌懸液OD600 nm值和活菌計(jì)數(shù)的動態(tài)變化中發(fā)現(xiàn)，O139型大腸桿菌整個(gè)生長階段有4個(gè)時(shí)期[11]。其接種初始濃度為3.168×107 CFU/mL，接種后0～3 h，處于適應(yīng)期，隨后進(jìn)入對數(shù)生長期（3～6 h），并持續(xù)約3 h，6～16 h為穩(wěn)定期，這一時(shí)期的活菌數(shù)最高且維持穩(wěn)定；16 h后曲線呈下滑趨勢，處于衰亡期（圖3）。

對O139型大腸桿菌與細(xì)菌數(shù)的相關(guān)性分析，結(jié)果表明它們存在極顯著的相關(guān)性? ? ? ? ?（P＜0.01），因此在生長期和穩(wěn)定期時(shí)，O139型大腸桿菌OD600 nm值與細(xì)菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=1.45x+8.77（r2=0.95），該曲線的回歸相關(guān)指數(shù)r2=0.95（圖4）。

2.3 雞傷寒沙門菌

從菌株的生長曲線可以看出（圖5），菌株的適應(yīng)性很強(qiáng)，初始接種濃度為1.52×? ? ?107 CFU/mL，生長迅速，培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)期，2～6 h為對數(shù)期，生長穩(wěn)定期為6～? ? ? ?16 h，16 h后出現(xiàn)菌體生物量減少的現(xiàn)象，處于衰亡期。

用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對雞傷寒沙門菌OD460 nm值與細(xì)菌數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明它們有極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），在生長期和穩(wěn)定期雞傷寒沙門菌OD值—細(xì)菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=4.50x+7.02（r2=0.95），曲線的回歸相關(guān)指數(shù)r2=0.95（圖6）。

2.4 鼠傷寒沙門菌

鼠傷寒沙門菌生長的適應(yīng)期為0～2 h，對數(shù)生長期為2～8 h，8 h～16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，16 h后進(jìn)入衰亡期（圖7）。

對鼠傷寒沙門菌OD460 nm值與活菌計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明它們之間有極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），在生長期和穩(wěn)定期鼠傷寒沙門氏菌OD值與細(xì)菌數(shù)對數(shù)曲線回歸方程是y=5.59x+7.67 （r2=0.97）。曲線的回歸相關(guān)指數(shù)r2=0.97（圖8）。

2.5 雞白痢沙門菌

從細(xì)菌生長周期中細(xì)菌懸液OD460值和活菌計(jì)數(shù)的動態(tài)變化中發(fā)現(xiàn)，雞白痢沙門菌整個(gè)生長階段有4個(gè)時(shí)期。其接種初始濃度為1.18×107 CFU/mL，0～1 h為適應(yīng)期，1～ 10 h處于對數(shù)生長期，10～16 h為穩(wěn)定期，16 h后為衰亡期（圖9）。

對雞白痢沙門菌OD值與活菌計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明它們有極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），在生長期和穩(wěn)定期雞白痢沙門菌OD值與細(xì)菌數(shù)對數(shù)曲線回歸方程為y=9.72x+6.60（r2=0.98），曲線的回歸相關(guān)指數(shù)r2=0.98（圖10）。

3? 討論

在細(xì)菌培養(yǎng)過程中不斷有培養(yǎng)液營養(yǎng)消耗和細(xì)菌代謝產(chǎn)物增加，同時(shí)死亡細(xì)菌的消融產(chǎn)物也會對菌液的OD值產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)研究表明，菌液隨時(shí)間延長OD值不斷增加。試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，菌液顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長變化明顯，由棕黃色逐步變?yōu)闇\黃色。

生長曲線體現(xiàn)了細(xì)菌在培養(yǎng)過程中的生長和繁殖規(guī)律，不同細(xì)菌在相同培養(yǎng)條件下生長曲線不同，相同細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下其生長曲線也存在差異。本研究以O(shè)8型大腸桿菌、O139型大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌等為研究對象，通過24 h連續(xù)培養(yǎng)，對OD值、細(xì)菌數(shù)的變化規(guī)律和相關(guān)性進(jìn)行分析和探討。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件構(gòu)建OD值和細(xì)菌數(shù)的直觀圖，結(jié)果表明其與理論圖形是一致的。從生長曲線圖形中發(fā)現(xiàn)整個(gè)生長階段有4個(gè)時(shí)期，這與相關(guān)文獻(xiàn)一致[7-9]。

細(xì)菌懸液的濃度和細(xì)菌菌液的混濁度呈正相關(guān)，因此檢測OD值能夠反映出菌液的濃度，濃度越高，說明生長的細(xì)菌越多。從試驗(yàn)中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OD值先增大，后逐漸趨于穩(wěn)定，說明菌液中的菌數(shù)也經(jīng)歷了一個(gè)先增多、后趨于穩(wěn)定的過程。試驗(yàn)設(shè)立的陰性對照組的OD值為0，從而消除干擾因素。

OD值和活菌計(jì)數(shù)，兩種測定方法在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)差異，這是因?yàn)镺D值反映的是總菌濃度，在對數(shù)生長期細(xì)菌數(shù)呈指數(shù)增加，死亡菌數(shù)很少可忽落不計(jì)，而在穩(wěn)定期尤其是衰亡期，有大量細(xì)菌死亡，活菌數(shù)逐漸減少而總菌數(shù)基本穩(wěn)定，這就造成了兩種測定方法繪制的生長曲線反映的穩(wěn)定期、衰亡期時(shí)間階段不同。因此在計(jì)算世代時(shí)間時(shí)，應(yīng)以活菌計(jì)數(shù)法為準(zhǔn)。細(xì)菌總數(shù)雖然是在穩(wěn)定期最多，但是在對數(shù)生長期細(xì)菌形態(tài)、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究細(xì)菌性狀、藥物抗菌作用等選擇此對數(shù)生長期最好[11-15]。

根據(jù)朗伯—比耳（Lambert-Beer）定律，溶液的濃度太高或太低，均能影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此OD值選擇在0.2～1的范圍。結(jié)合測量的數(shù)據(jù)，運(yùn)用Excel軟件繪制散點(diǎn)圖。由于繪制的散點(diǎn)圖的分布情況類似對數(shù)函數(shù)圖形，故選擇用y=a+blgx進(jìn)行擬合。令X′= lgx可將其化為y=a+bX′，其中X′是OD值，y是菌數(shù)的對數(shù)值，結(jié)果表明5種試驗(yàn)菌回歸相關(guān)指數(shù)都不小于0.95，從而說明在這個(gè)吸光度的范疇內(nèi)，細(xì)菌菌液的吸光度和細(xì)菌菌數(shù)具有顯著相關(guān)性。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對細(xì)菌濁度與活菌計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明它們之間存在著極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），通過構(gòu)建細(xì)菌濁度與細(xì)菌計(jì)數(shù)的數(shù)學(xué)模型，可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法的缺陷。

參考文獻(xiàn)

[1] 周杰．動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（預(yù)防獸醫(yī)學(xué)分冊 第2 版）[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2017.

[2] 李穎，關(guān)國華．微生物生理學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，2013.

[3] 張?jiān)Ｃ瘢梢姺止夤舛确▽?種細(xì)菌計(jì)數(shù)的研究[J]．中國藥事，2015，29（10）：1066-1068.

[4] 李恪梅，魏東，王秉翔，等．人用布氏菌疫苗濃度測定分光光度法的建立[J]．中國藥事，2011，25（3）：233-235.

[5] 陳士運(yùn)，沈旭，苗立中，等．應(yīng)用紫外分光光度法進(jìn)行禽多殺性巴氏桿菌（C48-1）細(xì)菌計(jì)數(shù)的研? ?究[J]．山東畜牧獸醫(yī)，2009，30：12-13.

[6] 姚火春．獸醫(yī)微學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[7] 中華人民共和國獸藥典2020版三部[S]．附錄.

[8] 周德慶．微生物學(xué)教程（第四版）[M]．北京：高等教育出版社，2020.

[9] 明道緒，劉永?。锝y(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)（第六版）[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2019.

[10] 楊廣．液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌濃度兩種測定方法比 較[J]．微生物學(xué)雜志，2005，25（4）：71-72.

[11] 劉麗英，劉濤，畢文超，等．白色念珠菌的生長曲線和世代時(shí)間測定[J]．武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18（3）：230-231.

[12] 王升智，高波，周智慧，等．重組大腸桿菌DH5ɑ生長曲線的測定[J]．獸醫(yī)科技，2010，11：96-98.

[13] 羅如松，郭愛珍，林荔雯，等．豬胸膜肺炎放線桿菌濁度與細(xì)菌計(jì)數(shù)的關(guān)系[J]．畜牧與獸醫(yī)，2005（10）：10-12.

[14] 張莉，吳潤，劉磊．22種中草藥對畜禽常見腸道病原菌的體外抑菌作用[J]．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（5）：7-11.

[15] 潘婷婷，肖治均，張?zhí)?，等．連翹葉提取物和殼聚糖不同配比復(fù)配保鮮劑對冷藏豬肉的保鮮作用研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（2）：188-191.