紫外分光光度法測(cè)定溶血率的研究

程賓+張紅宇+王莉+楊崇儀+趙祎

【摘 要】 目的：對(duì)紫外分光光度法測(cè)定吸收度計(jì)算溶血率時(shí)波長(zhǎng)的選擇進(jìn)行探討研究。方法：參考《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅩⅧ B中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則和中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則進(jìn)行溶血試驗(yàn)的研究。結(jié)果： 兔血紅細(xì)胞破裂后在541nm和576nm處有最大吸收；同一供試品分別采用541mm和576nm測(cè)定溶血率，結(jié)果無顯著性差異。結(jié)論：當(dāng)樣品本身在541nm或576nm處有吸收，干擾溶血率計(jì)算時(shí)可選擇另一不干擾波長(zhǎng)測(cè)定溶血率。

【關(guān)鍵詞】 紫外分光光度法；溶血率；波長(zhǎng)

【中圖分類號(hào)】R927.11 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）24-0031-03

Abstract：Objective To study the selection of wavelength when UV is used on the hemolytic rate. Methods According to the Guiding Principles of safety tests on traditional Chinese medicine injection in Annex XVIII B， Chinese Pharmacopoeia， 2010 Edition 1， and Technical Guidelines of studies on the irritability and hemolytic activity of traditional Chinese medicine and natural medicine. Results When rabbit red blood cells rupture， there is maximum absorption on 541 nm and 576 nm. There is no significant difference when a same sample was determined on 541 nm or 576 nm and calculate hemolytic rate. Conclusion When a sample have absoption on 541 nm or 576 nm and it interfere in hemolytic rate，we can choose another wavelength to determine the hemolytic rate.

Keywords：Ultraviolet Spectrophotometry；Hemolytic Rate； Wavelength

溶血與凝聚是滅菌制劑安全性質(zhì)量控制指標(biāo)之一，隨著國(guó)家對(duì)注射劑安全性的重視程度日漸增加，尤其是中藥注射劑，溶血與凝聚已成為安全性必檢項(xiàng)目之一?！吨袊?guó)藥典》2005年版、2010年版均收載了該方法，但在結(jié)果判斷中，藥典一直以肉眼目測(cè)作為樣品是否溶血的結(jié)果判斷方法。在“中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則”中收載了紫外分光光度法測(cè)定吸收度計(jì)算溶血率以判斷樣品是否溶血的方法，該指導(dǎo)原則中僅收載了545nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，但有部分注射劑，尤其是中藥注射劑可能本身在545nm有吸收，可造成對(duì)樣品溶血率測(cè)定的干擾。因此，筆者對(duì)紫外分光光度法測(cè)定溶血率時(shí)波長(zhǎng)的選擇進(jìn)行了以下研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SUB28恒溫水浴（Grant Instrument Ltd. England）；TLM16M型高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)廠）；LD4-2離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；UV-2550 PC型紫外分光光度計(jì)（島津儀器）；DHG-9075 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料 血塞通注射液（批號(hào)：08082413；黑龍江多多藥業(yè)有限責(zé)任公司）。氯化鈉注射液（批號(hào)：A100205p2，昆明南疆制藥有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳白兔由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[滇]2005-0008，發(fā)證機(jī)關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滇）2005—0005，發(fā)證機(jī)關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳。

2 方法與結(jié)果

2.1 兔血紅細(xì)胞溶血后最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

2.1.1 2%紅細(xì)胞混懸液的配制[1] 兔心臟取血4mL，用玻璃珠去纖維蛋白原使成脫纖血，加氯化鈉注射液，搖勻，離心15min（1000r/min），棄上清液，沉淀的的紅細(xì)胞用氯化鈉注射液同上法洗滌3次，至上清液不呈紅色，取沉淀紅細(xì)胞1mL，加氯化鈉注射液稀釋至50mL，混勻，即為2%紅細(xì)胞混懸液供用，用時(shí)混勻。

2.1.2 試驗(yàn)方法 取上述2%紅細(xì)胞混懸液2.5mL，分別加2.5mL氯化鈉注射液作為陰性管，加2.5mL蒸餾水作為陽性管，混勻，于37℃溫育，3h后取出，離心5min（1000r/min），在300～600nm進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定，測(cè)得最大吸收峰所在波長(zhǎng)。取性別、體重不同的10 只家兔心臟血重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.1.3 試驗(yàn)結(jié)果 陽性管與陰性管在300～600nm進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定，陰性管無最大吸收，陽性管最大吸收峰所在波長(zhǎng)見表1。

2.2 不同波長(zhǎng)測(cè)定溶血率的比較

2.2.1 2%紅細(xì)胞混懸液的配制 同“2.1.1 ”。

2.2.2 供試品溶液配制 取血塞通注射液用氯化鈉注射液稀釋制成20 mg/mL、10mg/mL、5mg/mL 3 個(gè)濃度作為供試液。

2.2.3 試驗(yàn)方法 每批次樣品每濃度分別取潔凈試管6 支，1、2號(hào)管為樣品管，3、4號(hào)管為陰性對(duì)照管，5、6號(hào)管為陽性對(duì)照管，按表2所示，依次加入2%紅細(xì)胞混懸液、氯化鈉注射液或蒸餾水和相應(yīng)濃度供試液，混勻，于37℃溫育，3h后取出，離心5min（1000mg/mL，采用分光光度法（545nm和576nm）測(cè)定各管吸收度[2]。

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果 以兩平行管吸收度平均值帶入公試：溶血率（%）=（樣品管-陰性管）/（陽性管-陰性管）×100 %，計(jì)算溶血率，重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)相同濃度供試液在不同波長(zhǎng)測(cè)定計(jì)算的溶血率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與相同濃度供試液545nm相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）結(jié)果見表3。

3 討論

在查閱采用紫外分光光度法測(cè)定計(jì)算溶血率的相關(guān)資料中發(fā)現(xiàn)：不同實(shí)驗(yàn)者使用的波長(zhǎng)不盡相同[3-5]，但實(shí)驗(yàn)3.1結(jié)果表明，取不同家兔心臟血，陰性管在300～600nm處均無最大吸收，說明在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，兔血紅細(xì)胞在不破裂發(fā)生溶血的情況下無可引起紫外-可見吸收的物質(zhì)釋放。血塞通注射液主要含三七總皂苷，一般來說，皂苷類成分僅在紫外區(qū)210nm或280nm有吸收，在可見區(qū)541nm和576nm并無吸收。而陽性管在541nm和576nm均有最大吸收峰，說明兔血紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血后所釋放的物質(zhì)可引起此二波長(zhǎng)的紫外吸收，選用性別、體重不同的家兔重復(fù)實(shí)驗(yàn)，說明不同家兔心臟血溶血后釋放物質(zhì)的紫外最大吸收峰所在波長(zhǎng)范圍穩(wěn)定，無明顯個(gè)體差異。

血塞通注射液為三七總皂苷制成的滅菌注射用水溶液，其主要成分具有溶血作用，因此，以不同濃度的血塞通注射液作為供試液，造成不同程度的溶血模型。采用545nm和576nm測(cè)定相同濃度血塞通注射液溶血管的溶血率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明選擇545nm或576nm測(cè)定溶血率均可得到一致的結(jié)果，雖然對(duì)于血塞通注射液來說在可見區(qū)并無吸收干擾，但部分中藥注射液本身在545nm處有紫外吸收，可能影響樣品溶血率的測(cè)定計(jì)算，在此情況下可考慮采用576nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。通過實(shí)驗(yàn)，筆者認(rèn)為除中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則中收載的溶血率測(cè)定波長(zhǎng)545nm外，還可選擇576nm作為測(cè)定波長(zhǎng)或在實(shí)驗(yàn)中以陽性對(duì)照管所測(cè)得的最大吸收峰所在波長(zhǎng)作為溶血率測(cè)定波長(zhǎng)，這都是對(duì)該方法的有益補(bǔ)充和完善，也可擴(kuò)大該方法在測(cè)定溶血率中的應(yīng)用。

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（編輯：陶希睿）