基于Super-GBS的高粱株高和節(jié)間數(shù)QTL定位

徐建霞 丁延慶 馮周，2 曹寧 程斌 高旭 鄒桂花 張立異

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州310021）

高粱（Sorghum bicolorL.Moench）作為世界第五大糧食作物，廣泛分布于世界的熱帶干旱和半干旱地區(qū)，為全球約5億人口提供糧食［1］。高粱作為C4作物，具有光合能力強(qiáng)、高生物學(xué)產(chǎn)量和高抗逆性（抗?jié)场⒖购?、耐鹽堿和耐貧瘠）及基因組相對(duì)較小等特點(diǎn)，已逐漸成為禾本科作物基因組研究的一個(gè)模式作物［2］。株型是高粱育種的重要組成部分，適宜的株高有益于養(yǎng)分及光合的有效利用、種植密度、抗倒伏，進(jìn)而有利于提高產(chǎn)量［3］。而且隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化推進(jìn)，農(nóng)村人口老齡化日益嚴(yán)重，農(nóng)村發(fā)展規(guī)?；N植已呈必然趨勢(shì)，對(duì)適合機(jī)械化生產(chǎn)的高粱新品種需求不斷增加。因此，挖掘控制高粱株高相關(guān)QTL，開(kāi)展遺傳機(jī)理研究，對(duì)利用分子標(biāo)記輔助育種開(kāi)展高產(chǎn)、易機(jī)化高粱新品種的選育提供理論依據(jù)。

目前，用于高粱數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus, QTL）定位的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR（simple sequence repeats）和SNP（single nucleotide polymorphism）等［4-5］。Reddy等［6］利用SSR標(biāo)記，對(duì)籽粒高粱M35-1和B35構(gòu)建的245份重組自交系群體（recombinant inbred lines, RIL）進(jìn)行基因型掃描，構(gòu)建含有237個(gè)標(biāo)記的高粱遺傳圖譜，確定了10個(gè)與株高相關(guān)的QTL；蘇舒［7］利用83個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)218個(gè)家系的RIL群體（T70/P603）開(kāi)展基因分型，鑒定了8個(gè)高粱株高QTL位點(diǎn)和4個(gè)節(jié)間數(shù)QTL位點(diǎn)；另有研究者利用飼草高粱構(gòu)建的126個(gè)家系RIL群體（不育系Tx623A/蘇丹草恢復(fù)系Sa）為研究對(duì)象，定位到4個(gè)控制株高的QTL，對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為24.75%-33.59%［8］。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于SNP標(biāo)記的高密度遺傳圖譜構(gòu)建以及重要農(nóng)藝性狀的QTL定位越來(lái)越多被報(bào)道，這些遺傳圖譜的標(biāo)記數(shù)量不斷增加，標(biāo)記間的遺傳距離減小，連鎖群趨于完整，連鎖圖對(duì)全基因組的覆蓋率增加，更有利于QTL/基因的精細(xì)定位。Zou等［9］利用全基因組重測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了包含244個(gè)RILs（籽粒高粱654/甜高粱LTR108）的SNP高密度遺傳圖譜，定位了57個(gè)影響高粱抽穗期、株高、節(jié)間數(shù)等性狀的QTL。通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（GBS）對(duì)460個(gè)RILs（籽粒高粱BTx623/籽粒高粱NOG）的基因分型，Kajiya-kanegae等［10］構(gòu)建了包含有3 710個(gè)SNP標(biāo)記的高粱遺傳圖譜，并定位了3個(gè)與株高相關(guān)性狀的QTL。Takanashi等［11］同樣利用GBS技術(shù)對(duì)272個(gè)甜高粱RILs（甜高粱Brandes/甜高粱Wray）的基因分型，挖掘到33個(gè)影響開(kāi)花時(shí)間、株高和生物量等性狀的QTL。目前，在控制株高的4個(gè)主要位點(diǎn)中（Dw1-Dw4）［12-13］，前3個(gè)已經(jīng)被克隆。Dw1（Sobic.009G230800）編碼參與細(xì)胞增殖調(diào)控的高度保守蛋白［14］，Dw2（Sobic.006G067700）編碼蛋白激酶［15］，而Dw3（Sobic.007G163800）編碼ABCB1生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［16］，這些蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)莖間長(zhǎng)度影響高粱株高。

由于國(guó)內(nèi)外用于QTL定位的高粱遺傳圖譜主要是“甜高粱/甜高粱”，“甜高粱/籽粒高粱”或“飼草高粱”雜交構(gòu)建的RILs，對(duì)籽粒高粱標(biāo)記輔助育種的可利用價(jià)值具有一定的局限性。

本研究利用籽粒高粱BTx623和貴州茅臺(tái)酒專用高粱紅纓子雜交構(gòu)建的RIL群體為研究材料，基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)構(gòu)建高粱的高密度遺傳連鎖圖譜，開(kāi)展株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)農(nóng)藝性狀的QTL定位，并鑒定QTL區(qū)間內(nèi)的候選基因，為后續(xù)的基因克隆提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以美國(guó)籽粒高粱品種BTx623為母本，貴州茅臺(tái)酒專用高粱品種紅纓子為父本，雜交得到F1代，經(jīng)單粒傳法，構(gòu)建包含205個(gè)家系的F2:7代RIL群體。親本之間在株型上存在顯著差異。BTx623株高較低（1.2-1.5 m），株型緊湊，而紅纓子株高較高（2.5-3.0 m），株型松散。親本與RIL群體分別于2020年在貴陽(yáng)（2020GY）、安順（2020AS）和樂(lè)東（2020LD），以及2021年在貴陽(yáng)（2021GY）和安順（2021AS）5個(gè)環(huán)境下進(jìn)行田間種植。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，行距60 cm，行長(zhǎng)2 m，株距25 cm，人工點(diǎn)播，適時(shí)進(jìn)行間苗定苗、追肥、除草和病蟲害防治等田間管理工作。

1.2 方法

1.2.1 表型調(diào)查及數(shù)據(jù)分析 在高粱成熟期，每個(gè)株系隨機(jī)選擇5個(gè)單株調(diào)查株高（plant height, PH）和節(jié)間數(shù)（internode numbers, IN），調(diào)查方法參照《高粱種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》中的相關(guān)規(guī)定［17］。利用Microsoft excel 2021和SPSS 21.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、正態(tài)分布檢驗(yàn)和相關(guān)性進(jìn)行分析。多環(huán)境聯(lián)合方差分析參照曹永策等［18］方法，根據(jù)下面公式計(jì)算廣義遺傳率（h2B）。

式中，根2g為基因型方差，公2ge為基因型與環(huán)境互作方差，義2e為環(huán)境方差，n為環(huán)境數(shù)目，r為試驗(yàn)重復(fù)數(shù)。

1.2.2 DNA提取和GBS重測(cè)序 2020年5月在貴陽(yáng)采集親本和RIL群體植株嫩葉，采用CTAB法［19］提取DNA，0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA純度和完整性，同時(shí)用Qubit? 2.0熒光測(cè)定計(jì)檢測(cè)DNA濃度。參照Qi等［20］方法，利用上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司建立的GBS技術(shù)對(duì)質(zhì)檢合格的每個(gè)單株DNA樣品基因型進(jìn)行鑒定。

1.2.3 QTL定位 基于已經(jīng)構(gòu)建的高密度連鎖遺傳圖譜（包含有1 910個(gè)SNP標(biāo)記，標(biāo)記間平均遺傳間距為0.47 cM）［21］，利用QTL IciMapping4.2軟件中完備區(qū)間作圖法（ICIM）［22］對(duì)株高和節(jié)間數(shù)在5個(gè)環(huán)境下進(jìn)行QTL檢測(cè)，步長(zhǎng)設(shè)定為0.1 cM，隨機(jī)抽樣1 000次，QTL定位的閾值LOD設(shè)置為2.5，并計(jì)算出每個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，采用“q＋性狀名稱英文縮寫＋染色體＋“.”＋QTL序號(hào)”的方式對(duì)QTL進(jìn)行命名。

1.2.4 QTL區(qū)間內(nèi)候選基因挖掘方法 在Sorghum QTL網(wǎng)站（http://aussorgm.org.au/sorghum-qtl-atlas/）查找已報(bào)道的QTL信息，結(jié)合BTx623參考基因組信息，確定候選區(qū)間的所有基因，利用植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome中的高粱參考基因組功能注釋信息（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），綜合分析Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http://geneontology.org/）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）預(yù)測(cè)基因執(zhí)行的生物學(xué)功能，對(duì)比水稻中已克隆基因的功能注釋來(lái)進(jìn)一步確定候選基因。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)藝性狀表型分析和相關(guān)性分析

對(duì)親本BTx623、紅纓子以及RIL群體在5個(gè)環(huán)境下株高和節(jié)間數(shù)表型數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果可知（表1），2個(gè)性狀在親本之間差異顯著，紅纓子的株高和節(jié)間數(shù)顯著高于BTx623。RIL群體2個(gè)性狀平均值介于雙親之間，且均出現(xiàn)雙向超親現(xiàn)象，5個(gè)環(huán)境的變異系數(shù)介于12.02%-27.46%。此外，RIL群體的2個(gè)性狀在5個(gè)環(huán)境下的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1，除2020LD的節(jié)間數(shù)峰度為1.6外，且數(shù)據(jù)分布表現(xiàn)為連續(xù)的近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，適合進(jìn)行QTL定位分析（圖1）。

表1 RIL群體中株高和節(jié)間數(shù)在5個(gè)環(huán)境下的表型統(tǒng)計(jì)Table 1 Phenotypic statistics of plant height and internode numbers in the RIL population in five environments

為了解不同環(huán)境下性狀間的相關(guān)性，對(duì)2個(gè)性狀開(kāi)展了Pearson相關(guān)性分析（表2）。相同性狀在不同環(huán)境間呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01），株高和節(jié)間數(shù)的平均相關(guān)系數(shù)R值分別達(dá)到0.83和0.68。株高與節(jié)間數(shù)在不同環(huán)境之間也呈顯著（P＜0.01）正相關(guān)關(guān)系，R值的范圍為0.302-0.884，平均值為0.561。方差分析結(jié)果（表3）得出2個(gè)性狀的基因型、環(huán)境及基因型×環(huán)境均存在極顯著差異（P＜0.01），株高和節(jié)間數(shù)廣義遺傳率分別為95.23%和85.78%，說(shuō)明這兩個(gè)農(nóng)藝性狀的表型差異主要由其本身的遺傳因素所決定，而受環(huán)境的影響較小。

表2 RIL群體中株高和節(jié)間數(shù)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of plant heighst and internode numbers in the RIL population

表3 株高和節(jié)間數(shù)間方差分析及廣義遺傳率Table 3 Variance analysis and broad heritability of plant height and internode numbers

2.2 株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)QTL定位

利用ICIM方法，在5個(gè)環(huán)境下共定位到18個(gè)QTL與高粱的株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)，分別位于高粱的5條染色體上。與株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)QTL分別有7和11個(gè)，而2個(gè)及以上環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到的QTL有10個(gè)，涉及到9個(gè)染色體區(qū)段（表4和圖2）。

圖2 高密度遺傳圖譜及重要QTL所在染色體示意圖Fig.2 Schematic diagram of high-density genetic map and chromosomes with important QTL regions

表4 株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)QTL定位結(jié)果Table 4 QTL mapping results of plant height and internode numbers

影響株高的7個(gè)QTL分別位于1、3、4和9染色體上。位于第4和9染色體上的2個(gè)重要QTL（qPH4.1和qPH9.1）能夠在3個(gè)環(huán)境下被檢測(cè)到，最大LOD值分別為5.83和24.84，可解釋的最大表型變異率分別為6.66%和34.34%。位于第1染色體的qPH1.2、位于第3染色體qPH3.1和qPH3.2在2個(gè)環(huán)境下被重復(fù)檢測(cè)到，其最大LOD值和表型貢獻(xiàn)率分別為10.14和15.19%。除qPH1.2外，其余6個(gè)QTL的增效等位基因均來(lái)源于親本紅纓子。

影響節(jié)間數(shù)的11個(gè)QTL分別位于第1、3、4、8和9染色體上。位于第9染色體上的2個(gè)重要QTL（qIN9.1和qIN9.3）在3個(gè)環(huán)境下都能被檢測(cè)到，它們的最大LOD值分別為4.45和7.92，可解釋的最大表型變異率分別為6.99%和10.05%。在11個(gè)與節(jié)間數(shù)相關(guān)的QTL中，3個(gè)QTL（qIN1.1、qIN8.1和qIN8.2）的增效等位基因來(lái)源于親本BTx623，其余8個(gè)QTL的增效等位基因均來(lái)源于親本紅纓子。

2.3 重要QTL基因注釋和候選基因功能預(yù)測(cè)

根據(jù)上述結(jié)果，對(duì)2個(gè)及以上環(huán)境都能定位到的10個(gè)重要QTL區(qū)段進(jìn)行了候選基因分析，利用植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome中的高粱參考基因組功能注釋信息（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），識(shí)別高粱基因ID、蛋白質(zhì)注釋信息預(yù)測(cè)基因執(zhí)行的生物學(xué)功能，對(duì)比水稻中已克隆基因的功能注釋并結(jié)合前人研究文獻(xiàn)，確定了5個(gè)候選基因（表5）。除了已經(jīng)克隆的控制株高Dw1，還注釋到4個(gè)新的候選基因。其中，2個(gè)基因與水稻株高相關(guān)基因同源，包括編碼對(duì)映型柯巴基焦磷酸合酶的基因Sobic001G248600和編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的Sobic003G227300，其水稻同源基因分別為OsCPS1（LOC_Os02g17780）和Dlf1（LOC_Os01g43650）。Sobic008G173300位于控制高粱節(jié)間數(shù)QTL區(qū)間內(nèi)，蛋白注釋為節(jié)間伸長(zhǎng)抑制因子，其水稻同源基因DEC1（LOC_Os12g42250）編碼一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子。Sobic003G227000所在QTL同時(shí)控制高粱株高和節(jié)間數(shù)，該基因編碼卵形家族蛋白，在水稻中的同源基因OsOFP2（LOC_Os01g43610）與多個(gè)發(fā)育過(guò)程相關(guān)。

表5 重要QTL區(qū)間候選基因功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes in important QTL intervals

3 討論

高粱是釀造貴州茅臺(tái)酒等醬香型白酒的主要原料［23］。隨著醬香型白酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，貴州酒用高粱種植面積急劇上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年貴州高粱生產(chǎn)面積達(dá)到約18.7萬(wàn)hm2，位居全國(guó)第一［24］。但是由于貴州酒用高粱品種普遍具有較高植株，不僅影響產(chǎn)量，也不適合機(jī)收［25］，導(dǎo)致勞動(dòng)力成本增加，影響農(nóng)民種植積極性，從而影響酒用高粱供給。因此，開(kāi)展貴州酒用高粱株高基礎(chǔ)研究，為品種遺傳改良提供依據(jù)，對(duì)白酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展意義重大。

作為多基因控制和易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，多年多點(diǎn)的表型鑒定和高密度遺傳圖譜的構(gòu)建是準(zhǔn)確挖掘影響株高相關(guān)性狀QTL的關(guān)鍵因素［26］。本研究對(duì)BTx623和紅纓子構(gòu)建的RIL群體株高和節(jié)間數(shù)于2020年在貴陽(yáng)、安順和樂(lè)東，以及2021年在貴陽(yáng)和安順5個(gè)環(huán)境條件下進(jìn)行表型鑒定。相關(guān)性分析顯示不同環(huán)境下相同性狀之間或不同性狀之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，株高與莖節(jié)數(shù)顯著相關(guān)，這與Zhao等［27］和Zou等［9］研究結(jié)果一致。而利用GBS技術(shù)構(gòu)建的連鎖圖譜，比SSR等分子標(biāo)記圖譜有更高的密度，具有更好的基因挖掘能力［11］。

利用Super-GBS技術(shù)構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，本研究定位了10個(gè)重要QTL位點(diǎn)在多個(gè)環(huán)境中或不同性狀間都被重復(fù)檢測(cè)到，其中，8個(gè)QTL位點(diǎn)（qPH1.2、qIN3.1、qPH4.1/qIN4.1、qIN8.1、qPH9.1/qIN9.1和qIN9.3）與已報(bào)道株高相關(guān)性狀位點(diǎn)一致。位于第1染色體的株高QTL（qPH1.2，25.81-27.00 Mb）與前人利用2個(gè)RIL群體（M35-1/B35和BTx623/IS3620C）報(bào)道的株高QTL定位結(jié)果一致［6,28］，在其置信區(qū)間的基因Sobic001G248600與水稻OsCPS1同源，編碼對(duì)映型柯巴基焦磷酸合酶，參與水稻赤霉素生物合成進(jìn)而影響株高［29］，而且其同源物也會(huì)對(duì)玉米株高產(chǎn)生較大影響［30］。位于第3染色體上與莖節(jié)數(shù)相關(guān)的QTL（qIN3.1，53.08-55.06 Mb）與來(lái)源于M71/SS79的RIL的株高QTL位置重疊［31］。在3個(gè)環(huán)境中，位于第4染色體的QTL（1.48-1.53 Mb）被檢測(cè)到與株高（qPH4.1）和節(jié)間數(shù)（qIN4.1）相關(guān)，與Liu等［32］利用RIL群體（Tx623/S.virgatum）定位的株高QTL位置一致。此外，在8號(hào)和9號(hào)染色體上檢測(cè)到與莖節(jié)數(shù)相關(guān)的3個(gè)QTL中，qIN8.1和qIN9.1與利用SAP群體的GWAS定位結(jié)果相近［27］，qIN9.3與2個(gè)RIL群體（M35-1/B35和BTx3197/Rio）定位的株高QTL結(jié)果一致［6,33］。而位于qIN8.1置信區(qū)間上的Sobic008G173300，與水稻的DEC1同源，編碼C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在水稻和大麥植株體內(nèi)過(guò)表達(dá)該基因會(huì)強(qiáng)烈抑制株高和節(jié)間伸長(zhǎng)［34］。然而，位于第3染色體上的一個(gè)重要染色體區(qū)段（56.08-57.95 Mb）包含2個(gè)相鄰的QTL位點(diǎn)（qPH3.1和qPH3.2/qIN3.2），在高粱中還未見(jiàn)報(bào)道與株高相關(guān)性狀有關(guān)。qPH3.1（56.08-56.14 Mb）和qPH3.2（56.41-56.90 Mb）與株高相關(guān)，qIN3.2（56.23-57.32 Mb）與節(jié)間數(shù)相關(guān)。qPH3.2/qIN3.2位點(diǎn)所在56.23-56.90 Mb區(qū)間包含了2個(gè)候選基因Sobic003G227000和Sobic003G227300。Sobic003G227000與水稻基因OsOFP2同源，編碼卵形家族，能夠介導(dǎo)KNOXBELL功能，參與多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程（如維管束發(fā)育）［35］；而Sobic003G227300與水稻基因Dlf1同源，負(fù)責(zé)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)Ehd2/RID1/Osld1表達(dá)，從而參與控制水稻花期和株高［36］。上述2個(gè)QTL位點(diǎn)在其他高粱株高的QTL定位中未見(jiàn)報(bào)道的可能原因有2個(gè)：一是目前株高QTL定位群體的親本多來(lái)源于國(guó)外甜高粱品種，而本研究的定位群體親本之一——酒用糯高粱品種紅纓子中可能攜帶不一樣的株高基因；另一個(gè)原因是應(yīng)用Sup-GBS標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建高密度圖譜，能夠定位到更多的株高相關(guān)的QTL，而目前報(bào)道的高粱株高QTL定位多采用SSR標(biāo)記［6,31-32,37］。

與水稻［38］、玉米［39］和小麥［40］等主要糧食作物相比，影響高粱株高的功能基因挖掘研究還存在較大差異［41］。截至目前，已報(bào)道控制高粱株高的主效基因有4個(gè)（Dw1-Dw4），除了位于第6染色體的Dw4以外，其余3個(gè)已被克?。?2］。本研究在3個(gè)環(huán)境中均檢測(cè)到位于第9染色體上的一個(gè)重要區(qū)段（54.55-58.47 Mb）與株高（qPH9.1）和莖節(jié)數(shù)（qIN9.2）相關(guān)，正好與Dw1（57.09-57.10 Mb）的位置一致［14］。但是Dw2、Dw3和Dw4沒(méi)有被檢測(cè)到，可能的原因是親本BTx623和紅纓子在這3個(gè)基因上沒(méi)有多態(tài)性。此外，對(duì)本研究發(fā)現(xiàn)的4個(gè)影響株高潛在的候選基因進(jìn)一步開(kāi)展克隆和功能分析，研究遺傳調(diào)控機(jī)制，開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，有望為高粱株高分子育種打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了包含205個(gè)RILs（Bx623/紅纓子）的SNP高密度遺傳連鎖圖譜。在5個(gè)環(huán)境下共定位到7個(gè)影響株高和11個(gè)影響節(jié)間數(shù)的QTL。在多個(gè)環(huán)境或2個(gè)性狀中均檢測(cè)到10個(gè)重要QTL位點(diǎn)，分別位于第1、3、4、8和9染色體，包含了已經(jīng)克隆的Dw1位點(diǎn)，同時(shí)鑒定出4個(gè)與株高和節(jié)間數(shù)相關(guān)的候選基因，與控制水稻株高相關(guān)基因同源。