單核細胞增生李斯特菌LMXJ15全基因組測序及分析

杜冬冬 錢晶 李思琪 劉雯菲 魏向利 劉長勇 羅瑞峰 康立超

（新疆農墾科學院分析測試中心 新疆生產建設兵團食品檢驗所, 石河子 832000）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人獸共患食源性致病菌，在自然環(huán)境廣泛存在，對多種惡劣環(huán)境有較強的耐受力，并且能通過多種途徑抵御食品加工過程的極端環(huán)境，從而在食品中存活［1］。研究顯示食用被LM污染的食物可導致患李斯特菌病，其臨床癥狀包括發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產和死胎等，孕婦、新生兒、老人和免疫功能低下的人為主要易感人群，病死率高達30%［2］。據研究統(tǒng)計，在發(fā)達國家有多次李斯特菌病暴發(fā)的報道。2011年，在美國28個州發(fā)生了由于食用被LM污染的香瓜而導致147人感染發(fā)生李斯特菌病暴發(fā)疫情，30人死亡［3］。在2018南非爆發(fā)了一次最嚴重李斯特菌病疫情，導致1 000多人患病，216人死亡［4］。我國LM感染引發(fā)的暴發(fā)事件和臨床病例報道較少，但LM在食品中的污染情況普遍存在，例如2010-2014年間遼寧省14個城市的食品中LM的檢出率為1.87%［5］；2016-2019年重慶市39個區(qū)縣的即食食品中檢出率為1.77%［6］。同時隨著抗生素的濫用，使得LM對抗生素耐藥性水平逐漸提高，導致LM的預防治療愈加復雜困難，對人們的健康產生嚴重的威脅［7］。

隨著測序技術迅速發(fā)展，大量的LM菌株完成基因組測序，為研究LM提供了參考信息。全基因組測序不僅有利于了解菌株遺傳背景和生理特性，以及基因組結構變化，進化關系和基因功能等［8］，而且也能通過分析基因組中的毒力基因來預測菌株的潛在致病性。多位點序列分型（mutilocus sequence typing, MLST）是通過對細菌的多個管家基因（abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA）測序后，分析不同等位基因間的差異從而確定菌株間的相關性和進化關系［9-10］。

目前關于新疆地區(qū)食源性LM的基因組研究報道較少，本研究對一株新疆某地區(qū)分離的食源性LM進行了全基因組測序，分析了其攜帶的毒力基因，并與其它地區(qū)和國家來源菌株進行了親緣關系的比較，為研究本地區(qū)的LM分子特征提供了參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 單核細胞增生李斯特菌LMXJ15菌株由新疆農墾科學院分析測試中心微生物鑒定室從新疆某地的調理肉制品中分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI），北京路橋有限公司；單核細胞增生李斯特菌診斷血清，日本DENKS SEIKEN公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術有限公司；臺式高速冷凍離心機，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序和拼接 將LMXJ15菌株劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)進行活化，挑取單菌落接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h。按照DNA提取試劑盒說明書提取LMXJ15菌株的基因組DNA，并通過瓊脂糖電泳和核酸蛋白測定儀（SMARTSPEC PIUS，美國BIO-RAD）檢測，確保提取基因組的質量和濃度。提取的LMXJ15菌株DNA由生工生物工程（上海）股份有限公司采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺進行全基因組測序和拼接組裝。

1.2.2 基因預測與注釋 采用Glimmer 3.02軟件進行開放閱讀框（open reading frame，ORF）預測，Prokka對組裝結果進行基因元件預測，CRISPR預測采用CRT，將所有預測蛋白序列與Gene Ontology（GO）數(shù)據庫比對，完成蛋白序列的功能注釋。

1.2.3 血清型鑒定 利用單核細胞增生李斯特菌血清型鑒定試劑盒的方法測定分離株LM的O和H抗原，并結合參照Doumith等［11］的多重PCR方法中的引物序列與基因組序列匹配方法確定LM血清型。

1.2.4 毒力基因預測及分析 通過VirulenceFinder-2.0 Server（https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/）分析LMXJ15菌株的毒力基因攜帶情況。

1.2.5 MLST分析 對LMXJ15菌株的基因組序列與其它從 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）網站下載的72株LM全基因組序列通過https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/進行分析，確定單核細胞增生李斯特菌的7個管家基因（abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA）的等位基因號和ST型別及CC復合克隆系。

2 結果

2.1 LMXJ15菌株的基因組特征

采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺獲得LMXJ15菌株的完成圖?；蚪M序列總長度（genome size）為3 017 732 bp，平均GC含量為37.81%?；蝾A測分析，獲得編碼基因（CDS No）3 154個，編碼57個tRNA、6個rRNA，編碼基因總長度為2 734 315 bp，平均長度為866.94 bp。

2.2 CRISPR預測結果

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）是一類獨特的DNA正向重復序列家族，通常由長度為25-48的重復序列以及單一序列間隔組成［12-13］。CRISPR的作用機制類似于真核生物的RNAi，即利用間隔區(qū)識別并沉默外源的遺傳物質。CRISPR/Cas系統(tǒng)為細菌抵抗外來基因片段的自身免疫系統(tǒng)，對LM的致病性、耐藥性及新陳代謝具有重要作用［14］。LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列，位于染色體上的270 451-270 928 bp位置，長度為478 bp（表1），提示LMXJ15菌株可能通過CRISPR途徑提供相應的獲得性免疫，來對抗侵略細菌的外源DNA、質粒和噬菌體，提高在自然環(huán)境中的適應性。

表1 LMXJ15菌株的CRISPR序列Table 1 CRISPR sequences of strain LMXJ15

2.3 GO注釋結果

GO注釋結果（圖1）顯示，LMXJ15基因組中有2 241個基因得到了功能注釋，占所有編碼基因的75.03%，包括細胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）三大類（圖2）。在BP這一層面得到22種功能注釋，其中和代謝有關基因數(shù)量、與細胞過程相關基因最多。在CC層面得到17種功能注釋，其中細胞膜和細胞膜組分功能相關的基因最多。在MF層面得到12 種功能注釋，其中與催化活性和細胞附著有關的基因最多。

圖1 CRISPR重復片段的SeqLogo圖Fig.1 SeqLogo plot of CRISPR repeats

圖2 LMXJ15菌株基因的GO功能分類Fig.2 GO functional classification of genes of strain LMXJ15

2.4 血清鑒定結果

血清型是細菌分型中非常重要的意義，往往和細菌的毒力、宿主特異性疫苗是否有保護性相關［15］。本研究利用鑒定LM的O和H抗原、對已獲得的基因組序列和血清分型相關基因及特異性引物進行匹配，鑒定LMXJ15菌株為1/2a血清型。

2.5 毒力基因預測

通過VirulenceFinder-2.0 Server的毒力基因預測顯示，LMXJ15菌株攜帶88個毒力相關基因，其中與表達調控相關的基因10個，與耐受環(huán)境壓力相關的基因21個，與逃避宿主免疫系統(tǒng)作用相關的毒力基因18個，與侵襲和黏附相關的毒力基因26個，與生存和增殖相關的毒力基因12個，其他相關毒力相關基因2個（表2）。

表2 LMXJ15菌株基因組上的致病相關基因Table 2 Pathogenicity-related genes on the genome of strain LMXJ15

2.6 MLST分析結果與基因組共線性分析

對72株單核細胞增生李斯特菌分型結果顯示如表3，通過7個保守基因序列進行分子進化樹構建（圖3），結果顯示72株菌分成3個不同的分支，并呈現(xiàn)譜系聚類，譜系I和譜系II分別含有25和28個進化分支，譜系III含有4個進化分支，顯示菌株進化關系與血清型有較為直接的關系。譜系I中主要以4b血清型菌株最多，譜系II中主要為1/2a血清型菌株。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復合克隆系，與意大利分離株IZSAM_Lm_15_17439_A144、瑞士分離株LmN1546和一株從熏鮭魚分離菌株R479a在同一個進化分支上，親緣關系較近，具有相同的ST型和血清型（1/2a）。采用Mauve 軟件對4株菌株進行共線性分析，結果如圖4所示，菌株間基因組的相似度較高，含有9個較大的本地共線性模塊（locally colinear blocks, LCB），但是它們所在的區(qū)域以及排列順序有一定的差異。

圖3 72株單核細胞增生李斯特菌基于MLST管家基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of 72 Listeria monocytogenes strains based on the housekeeping gene sequences of MLST

圖4 全基因組共線性分析Fig.4 Whole genome alignment analysis

表3 72株單核細胞增生李斯特菌MLST分型結果Table 3 MSLT typing results of 72 strains of Listeria monocytogenes

3 討論

LM是一種人畜共患病病原菌，具有分布廣、耐受力強和致病力高等特征，通過污染食品來傳播疾病，孕婦、新生兒及免疫力低下的成人為主要易感人群，感染后將引起敗血癥、腦膜炎、孕婦流產及新生兒死亡，病死率高達30%，因此被WHO列為四大食源性致病菌之一［16-17］。近幾年，全國各地大量食品污染監(jiān)測數(shù)據表明，LM在各類食品中存在不同程度的污染，其風險不容忽視［18-20］。但由于中國居民飲食習慣的差異以及對食源性致病菌監(jiān)控體系建立起步較晚，目前對該致病菌的監(jiān)測數(shù)據少，分離株數(shù)量少，大量的研究工作仍然停留在污染監(jiān)測上，同樣在新疆地區(qū)也是如此，對于LM分子遺傳特征闡述與分析的數(shù)據量低，數(shù)據的缺失，使得防控出現(xiàn)空白。因此闡明LM的血清型、分子分型、基因組功能特性和毒力基因攜帶情況，對LM的預防與控制具有重要的意義。

本研究通過PacBio和Illumina HiSeq測序平臺完成了1株分離自調理肉制品的單核細胞增生李斯特菌LMXJ15的全基因組測序，基因總長度為3 017 732 bp，GC含量為37.81%，預測到3 154個編碼基因，其中編碼基因總長度為2 734 315 bp，平均長度為866.94 bp，基因中包含6 個rRNA操縱子和57個tRNA。通過CRISPR預測，LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列，位于染色體上的270 451-270 928 bp位置，長度為478 bp，說明菌株LMXJ15可能通過CRISPR途徑提供相應的獲得性免疫，提高在環(huán)境中適應能力。

通過血清型分析LMXJ15為1/2b型，對LMXJ15與臨床、食品、動物、環(huán)境相關的LM（NCBI上公布）進行MLST比較分析并構建進化樹，發(fā)現(xiàn)72株菌株主要屬于CC6、CC7、CC8、CC9復合克隆系，同時呈現(xiàn)譜系聚類。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復合克隆系，屬于譜系II，與意大利IZSAM_Lm_15_17439_A144臨床分離株［21］、瑞士LmN1546臨床分離株［22］和一株從熏鮭魚中分離的R479a菌株［23］具有相同ST型血清型（1/2a），并在同一個進化分支上，對這4株LM的基因組共線分析結果顯示高度相似，其毒力因子的數(shù)目也相同，這與梁慧賢等［24］的研究結果相類似，毒力基因的分布與遺傳進化表現(xiàn)出一定的相關性。

LM成功入侵宿主細胞中存活、增殖需要多種毒力因子在不同感染階段發(fā)揮作用［25］，對LMXJ15毒力分析顯示，不僅具有hpt、pycA、fri、relA、oppA、lplA1、prsA2、chiA、dal、fur、pgl、stp等毒力因子來提高在各種環(huán)境中的生存能力，還有促進LM入侵宿主上皮細胞且在感染動物的毒性表型中具有重要作用的inlA、inlB、inlF、inlH、inlJ、lap等毒力因子，以及在自噬識別逃逸中發(fā)揮重要作用的hly、plcA、plcB、mpl等毒力因子，這些表明LMXJ15菌株具有較強的毒力，有感染人患病的風險。

4 結論

LMXJ15基因組大小為3 017 732 bp，包含3 154個基因，其中GO中注釋有2 241個基因；通過CRISPR預測LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列；MLST比較分析LMXJ15屬于CC8復合克隆系ST8型，與人源臨床分離株親緣關系較近、基因組高度相似性，并且攜帶有多種毒力因子。本研究豐富了單核細胞增生李斯特菌的基因組數(shù)據庫，為新疆地區(qū)單核細胞增生李斯特菌的研究提供了參考數(shù)據。