DNA甲基化在解析毛竹自然變異中的應(yīng)用

李英 岳祥華

（1.國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，北京 100102；2.國家林業(yè)和草原局 北京市竹藤科學(xué)與技術(shù)重點開放實驗室，北京 100102； 3.國際竹藤中心三亞研究基地，三亞 572000）

我國是全球竹資源最豐富的國家，竹子種類、竹林面積和蓄積量均居世界之首。毛竹（Phyllostachys edulis）是我國竹類資源中栽培面積最大的竹種，毛竹林則是我國竹林的主要組成部分［1］。根據(jù)第九次全國森林資源清查數(shù)據(jù)顯示，我國毛竹林面積467.78萬hm2，占竹林總面積的72.96%［2］。但是，竹類植物優(yōu)異種質(zhì)資源挖掘嚴(yán)重不足，基礎(chǔ)研究薄弱，嚴(yán)重影響了竹類植物資源的創(chuàng)新應(yīng)用［3］。

毛竹是禾本科喬灌木，長期處于野生狀態(tài)。由于開花周期長且大部分竹種花后很快干枯死亡，毛竹主要通過帶芽的地下莖（也稱“竹鞭”）、竹稈和竹枝等進(jìn)行無性繁殖［4］。但是，在長期的演化過程中毛竹產(chǎn)生了豐富的自然變異體即突變體，它們大多由當(dāng)?shù)鼐用裨谝吧拿窳种信既坏匕l(fā)現(xiàn)［5］。很顯然，這些突變體由于體細(xì)胞突變所引起；而植物的分化發(fā)育是功能基因、調(diào)控因子和表觀修飾等共同作用的結(jié)果。系統(tǒng)闡釋毛竹自然突變體形成的調(diào)控機(jī)制不僅是竹類植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)理論問題，而且對竹子材性改良及竹林生長量提高均具有重要意義。本文綜述了毛竹自然變異研究現(xiàn)狀、植物DNA甲基化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在植物發(fā)育過程中的研究進(jìn)展，并展望了DNA甲基化在解析毛竹自然變異現(xiàn)象的潛在應(yīng)用。因此，充分利用毛竹豐富的自然突變體材料，運用多領(lǐng)域技術(shù)方法聯(lián)合分析策略，解析關(guān)鍵突變表型或性狀的形成機(jī)制，有利于指導(dǎo)竹子精準(zhǔn)育種。

1 毛竹自然變異研究進(jìn)展

目前，中國竹類植物圖鑒中記載了共17種毛竹自然突變體［6］，它們在竹稈形態(tài)、顏色和節(jié)間形態(tài)等多個方面與野生型毛竹有明顯差別，分別是蝶毛竹（P.edulisf.abbreviate）、綠槽毛竹（P.edulisf.bicolor）、麻衣竹（P.edulisf.exaurita）、金絲毛竹（P.edulisf.gracilis）、黃皮毛竹（P.edulisf.holochrysa）、黃皮花毛竹（P.edulisf.huamozhu）、黃槽毛竹（P.edulisf.luteosulcata）、綠皮花毛竹（P.edulisf.nabeshimana）、強(qiáng)竹（P.edulisf.obliquinoda）、梅花竹（P.edulisf.obtusangula）、厚壁毛竹（P.edulisf.pachyloen）、斑毛竹（P.edulisf.porphyrosticta）圣音竹（P.edulisf.tubaeformis）、佛肚毛竹（P.edulisf.ventricosa）、龜甲竹（P.edulisf.Kikko-chiku）、花龜竹（P.edulisf.Mira）和青龍竹（P.edulisf.curviculmis）。其中，綠槽毛竹、綠皮花毛竹、斑毛竹、黃槽毛竹、黃皮花毛竹和黃皮毛竹主要在竿的顏色方面與野生型毛竹存在明顯區(qū)別，而蝶毛竹、強(qiáng)竹、梅花竹、圣音竹、佛肚毛竹、龜甲竹、花龜竹、青龍竹和麻衣竹主要在竿的形態(tài)方面與野生型毛竹存在明顯區(qū)別，至于厚皮毛竹和金絲毛竹主要在竿壁厚度方面與野生型毛竹存在明顯區(qū)別。

多位學(xué)者就毛竹及其變種的生態(tài)學(xué)特性［7］、生理生化特性［8］以及出筍規(guī)律和鞭根結(jié)構(gòu)［9-10］等進(jìn)行了研究。據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)，與野生型毛竹相比，自然突變體在組織形態(tài)、激素水平以及生態(tài)效應(yīng)等方面存在明顯差異。此外，多名學(xué)者運用EST、AFLP和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，開展了野生型毛竹及其變竹的遺傳變異研究［11-12］。近年來，高通量測序技術(shù)快速發(fā)展。南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所在毛竹和多個自然突變體植株發(fā)育早期的筍芽中鑒定到與維管分生組織發(fā)育相關(guān)的基因，并且它們主要富集在細(xì)胞壁構(gòu)型、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)過程［13］。作者團(tuán)隊前期選取野生型毛竹及其壁厚變種厚竹（P.edulisf.pachyloen）不同發(fā)育時期的地下筍芽為材料，聯(lián)合運用多組學(xué)測序技術(shù)繪制了毛竹及其變型厚竹的5個不同發(fā)育時期筍芽內(nèi)部基因和miRNA動態(tài)表達(dá)圖譜，基因共表達(dá)趨勢分析結(jié)果顯示大部分基因在發(fā)育前期存在明顯的折點，并且該折點在厚竹和毛竹樣本中方向相反；有趣的是，野生型毛竹及其突變體表型出現(xiàn)明顯差異也是在這個時期。此外，該研究挖掘了調(diào)控筍芽發(fā)育的miRNA-mRNA模塊，發(fā)現(xiàn)了植物激素細(xì)胞分裂素在促進(jìn)筍芽發(fā)育中的關(guān)鍵作用，利用雙熒光素酶報告基因技術(shù)和RNA FISH等技術(shù)驗證了miRNA與靶基因間的靶向調(diào)控關(guān)系及其在筍芽分生組織中的作用位點［14］。該成果發(fā)掘了調(diào)控竹子筍芽發(fā)育的關(guān)鍵遺傳因子，初步闡釋了筍芽組織形態(tài)動態(tài)變化的分子機(jī)理，剖析了毛竹與厚竹表型明顯差異的分子基礎(chǔ)。但是，稈壁增厚這一突變表型發(fā)生的原因尚不清楚。目前，毛竹自然變異相關(guān)研究局限在資源評價、轉(zhuǎn)錄組分析，表觀修飾對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效應(yīng)及其作用機(jī)制仍不清楚。

2 DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)性

DNA甲基化（methylation）是真核細(xì)胞普遍的一種重要的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)表觀遺傳修飾方式。DAN 甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methylthransferases，DNMTs）的作用下，以S-腺苷加硫氨酸（SAM）為供體，將甲基添加到特定堿基的過程［15］；該過程主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸CpG中胞嘧啶第五位碳原子上，其產(chǎn)物稱為5-甲基胞嘧啶（5-mC）［16］。5-mC是真核生物DNA甲基化的主要形式，此外還存在N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）和7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。無論在植物還是動物中，CpG部分散在分布于基因組DNA序列中，部分則以高度聚集的CpG島狀態(tài)存在于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，如啟動子區(qū)。在植物中，DNA甲基化往往發(fā)生在對稱序列CG、CHG和非對稱序列CHH（H=A、C或T）中［17］。與基因突變不同，DNA甲基化是一種可逆的化學(xué)修飾，目前發(fā)現(xiàn)的植物甲基化主要有從頭甲基化（de novomethylation）、維持甲基化（maintenance methylation）和去甲基化（demethylation）3種模式。

以往研究結(jié)果顯示DNA甲基化異常往往能夠改變DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致多種生物學(xué)通路的路徑發(fā)生改變［18］。研究發(fā)現(xiàn)小麥基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化能夠調(diào)控對基因的表達(dá)［19］。在某些情況下，啟動子區(qū)DNA甲基化非但不抑制基因轉(zhuǎn)錄，相反會促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，如擬南芥的ROS1基因［20-22］和一些抑制番茄果實成熟的基因［23-24］。最近，北京林業(yè)大學(xué)油松研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)油松（Pinus tabuliformis）基因組存在大量高表達(dá)的大內(nèi)含子基因，DNA甲基化修飾在外顯子和內(nèi)含子區(qū)表現(xiàn)出很高的不均衡分布，作者預(yù)測DNA甲基化對基因不同區(qū)域的差異化轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮了關(guān)鍵作用［25］。中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心朱健康研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠以多種方式調(diào)控基因的表達(dá)，并表示DNA甲基化在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程扮演重要角色［26］。此外，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與組蛋白甲基化間存在協(xié)同作用［27-28］，DNA甲基化與組蛋白修飾及非組蛋白共同決定了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和開放程度，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)座子沉默、染色質(zhì)互作以及性狀遺傳［29］。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化修飾后，序列特異性甲基化結(jié)合蛋白（methyl cytosine binding protein,MeCP）與之結(jié)合，隨后組蛋白去乙?；瘡?fù)合物與MeCP 結(jié)合作用于組蛋白使其發(fā)生去乙?；?，接著染色體狀態(tài)處于緊縮狀態(tài)，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程不能正常啟動，進(jìn)而時空性調(diào)控植物發(fā)育調(diào)控因子的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化以至關(guān)鍵發(fā)育過程，最終可能導(dǎo)致植物性狀的畸形［30］。

值得注意的是，研究表明部分非編碼RNA可能調(diào)控DNA 甲基化修飾效應(yīng)。microRNA（miRNA）、long non-coding RNA（lncRNA）、circular RNA（circRNA）等非編碼RNA同樣存在大量的內(nèi)含子序列［31］，經(jīng)過剪切能夠形成特異二級結(jié)構(gòu)，并以此行使生物學(xué)功能［32-33］。Song等［34］研究發(fā)現(xiàn)一類24 nt的miRNA能夠調(diào)控毛白楊花發(fā)育通絡(luò)相關(guān)基因的甲基化實現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)。有趣的是，針對野生型毛竹及其突變體厚竹兩個樣本組間鑒定到的DEmiRs，作者進(jìn)行了靶基因預(yù)測以及功能富集分析，結(jié)果顯示這些靶基因主要富集在DNA甲基化和蛋白磷酸化生物學(xué)過程。這一發(fā)現(xiàn)表明竹子miRNA可能調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，通過甲基化修飾過程，進(jìn)而調(diào)控竹子筍芽組織的分化和發(fā)育，為發(fā)掘厚竹自然變異形成機(jī)制提供了新的視角。植物中DNA甲基化研究仍然主要集中在蛋白編碼區(qū)，而對占基因組近90%的非編碼區(qū)域尚未系統(tǒng)開展，加之非編碼區(qū)域是DNA甲基化修飾的富集區(qū)，開展非編碼區(qū)域基因序列的DNA甲基化修飾研究有助于全面理解和解析基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3 DNA甲基化是植物發(fā)育過程的關(guān)鍵因子

植物組織的分化和發(fā)育是基因在一定的時間和空間特異性表達(dá)的結(jié)果。而表觀遺傳修飾能從多個水平上調(diào)控基因的表達(dá)［17］；并且不同植物不同水平的調(diào)控之間相互關(guān)聯(lián)，構(gòu)成了一個復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。DNA甲基化［35］，作為真核細(xì)胞普遍的一種重要的表觀遺傳修飾方式，它能夠在不改變DNA序列的前提下調(diào)控基因的表達(dá)水平和模式，進(jìn)而影響植物組織的生長和發(fā)育等重要生物過程［36］。在擬南芥中，僅有約5%的基因的啟動子區(qū)存在甲基化，對于大多數(shù)基因來說DNA甲基化并不調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄，因此大多數(shù)DNA甲基化水平的增加或降低并不會導(dǎo)致嚴(yán)重的生長和發(fā)育缺陷。而作物和林木樹種擁有更大的基因組，基因間區(qū)存在較密集的轉(zhuǎn)座子，同時甲基化水平也較高。例如，Niu等［25］發(fā)現(xiàn)中國松基因組的巨大性主要來源于轉(zhuǎn)座元件，而 DNA甲基化通過抑制轉(zhuǎn)座元件進(jìn)一步復(fù)制對基因組進(jìn)行監(jiān)管。不難看出，轉(zhuǎn)座子或其他重復(fù)序列的甲基化擴(kuò)散將使得啟動子區(qū)的DNA甲基化更為普遍。因此，DNA甲基化在某些作物和林木中作用于基因表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)比在擬南芥中更加重要，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的生長和發(fā)育缺陷甚至死亡。

Cubas等［37］以花型為兩側(cè)對稱的野生型柳穿魚和花型為輻射對稱的突變體為研究材料，通過比較發(fā)現(xiàn)Lcyc基因啟動子區(qū)在突變體中存在廣泛甲基化，轉(zhuǎn)錄受到抑制；并且這種甲基化修飾是可遺傳的，可與突變表型共分離。有趣的是，突變體在體細(xì)胞發(fā)育過程中偶爾會發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)，并且這與Lcyc的去甲基化和基因表達(dá)的恢復(fù)有關(guān)。這表明表觀遺傳突變可能在生物表型的遺傳、發(fā)育和進(jìn)化中發(fā)揮重要的作用。Ong-Abdullah等［38］發(fā)現(xiàn)在油棕體細(xì)胞克隆株系中，Karma轉(zhuǎn)座子剪接位點周圍區(qū)域若存在密集的甲基化位點則正常坐果，而低甲基化則預(yù)示同源轉(zhuǎn)化、單性結(jié)實和產(chǎn)量驟降。

此外，DNA甲基化在植物生殖器官發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。王子成等［39］發(fā)現(xiàn)菊花（Chrysanthemum morifolium）經(jīng)5-azaC處理后植株的甲基化水平降低，開花時間提前，而其他表型性狀未受影響。此外還發(fā)現(xiàn)在亞棉花藥敗育過程中，基因組DNA甲基化程度明顯升高［40］。Walker等［41］發(fā)現(xiàn)一種獨特的RNA定向DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）能夠調(diào)控擬南芥雄性株系減數(shù)分裂細(xì)胞中的基因表達(dá)；而RdDM活性的缺失導(dǎo)致MPS1基因的錯誤剪接，從而破壞減數(shù)分裂。Manning等［42］發(fā)現(xiàn)當(dāng)位于番茄Cnr（Colorless non-ripening）位點的Squamosa-promoter binding protein（SBP）-box基因的啟動子區(qū)發(fā)生DNA超甲基化突變時，果肉無色，細(xì)胞間黏附性大幅下降，抑制了番茄果實的成熟。此外，Wang等［43］發(fā)現(xiàn)番茄果實成熟過程中DNA甲基化能夠影響數(shù)百個多拷貝的轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平；并且對于某一多拷貝基因來說，其中一個基因拷貝總是明顯高于或者低于其他拷貝的甲基化程度，作者推測DNA甲基化促進(jìn)了果實成熟通路轉(zhuǎn)錄因子基因的趨異進(jìn)化，并在番茄果實成熟等重要生物過程發(fā)揮調(diào)控作用。

可以看出，無論是對于有性還是無性繁殖后代來說，DNA甲基化修飾所引起的變異都存在廣泛性和顯著性。研究結(jié)果顯示在植物無性繁殖過程中，DNA甲基化的增加或減少都有可能導(dǎo)致可遺傳的表型改變［44］。對于大多數(shù)無性繁殖的植物多通過分離具有分生組織的萌蘗、根狀莖、塊莖以及珠芽等營養(yǎng)器官的方式進(jìn)行，而在頂端分生組織［45］、根尖分生組織［46-47］以及花芽分生組織［48］等細(xì)胞中廣泛存在著多種甲基化標(biāo)記［17］。毛竹竹蔸、竹枝和竹稈上的芽能夠發(fā)育成地下部分的竹鞭和地上部分的竹稈等，因此多通過分株、埋枝、移鞭等無性繁殖技術(shù)進(jìn)行繁殖。一旦突變發(fā)生在某個分生組織細(xì)胞中，很容易產(chǎn)生大量攜帶突變的衍生細(xì)胞，進(jìn)而影響或者徹底改變該組織的形態(tài)；或者在分生組織中某些生物過程被異常地激活，進(jìn)而影響到與之關(guān)聯(lián)的非分生組織細(xì)胞中某些基因的表達(dá)調(diào)控［26,49］。毛竹基因組大小約為2.0 Gb，其中60%為DNA重復(fù)序列［50-51］，轉(zhuǎn)座元件種類豐富且功能多樣［52-54］。不難看出，雖然毛竹主要進(jìn)行無性繁殖，但是在長期的進(jìn)化過程中DNA甲基化很可能通過調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)座子沉默、染色質(zhì)互作等影響了某些性狀的遺傳和變異。但是，目前基于DNA甲基化的毛竹自然突變體形成的分子機(jī)制研究尚沒有報道。

4 DNA甲基化與基因組編輯技術(shù)

隨著基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展，植物表觀基因組的定向修飾研究取得了新成果。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所曹曉風(fēng)院士課題組在擬南芥中證實了DNA甲基化抑制胞嘧啶脫氨酶催化的C→T轉(zhuǎn)換效率，并成功篩選獲得了對甲基化胞嘧啶高效編輯的單堿基編輯器APOBEC3BCtd-nCas9，該蛋白能夠有效編輯擬南芥和水稻中甲基化胞嘧啶，并可對編輯框內(nèi)多個胞嘧啶實現(xiàn)單個C→T的精準(zhǔn)編輯［55］。該團(tuán)隊的另一研究則基于SunTag-dCas9-TETcd系統(tǒng)，成功構(gòu)建了一套針對水稻基因組DNA甲基化靶向刪除的表觀編輯體系，成功刪除PRC2復(fù)合體關(guān)鍵成員OsFIE1基因和逆轉(zhuǎn)座子Tos17位點DNA甲基化并實現(xiàn)二者異位表達(dá)，獲得了一系列不同程度矮化的表觀等位突變體，他們還發(fā)現(xiàn)OsFIE1的低甲基化水平和植株矮化表型能夠穩(wěn)定遺傳并且不依賴外源轉(zhuǎn)基因載體［56］。該研究首次在禾本科作物中建立了表觀編輯體系，為竹類植物的遺傳改良提供了新的工具和思路。

然而，目前竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、遺傳轉(zhuǎn)化效率較低仍是竹子遺傳改良研究面臨的瓶頸問題，在竹類植物研究領(lǐng)域尚未見定點DNA 甲基化修飾研究的相關(guān)報道。因此，今后應(yīng)致力于高效再生體系的建立，構(gòu)建病毒基因載體［57］、納米基因載體［58］等介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時聯(lián)合經(jīng)典遺傳學(xué)和CRISPR/Cas9的方法，利用基因組編輯技術(shù)對植物基因組進(jìn)行定點或者多位點的DNA甲基化修飾，這將為闡述具有DNA甲基化位點調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對于植物組織分化發(fā)育過程表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的精確解析具有重要意義。

5 總結(jié)與展望

毛竹自然變異形成過程調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，涉及生理生化指標(biāo)、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及DNA甲基化修飾等多層次、多因子的作用，這為系統(tǒng)闡述毛竹自然變異形成的分子調(diào)控機(jī)制提供了大量有價值的信息。但是過去的研究尚存在以下不足：（1）先前的研究主要集中在竹子材性品質(zhì)形成，快速高生長和開花調(diào)控方面，而對自然突變體這一優(yōu)異種質(zhì)資源挖掘嚴(yán)重不足、基礎(chǔ)研究滯后；（2）DNA甲基化已被證實在體細(xì)胞突變等自然變異過程發(fā)揮重要作用，但是，針對毛竹自然變異的DNA甲基化效應(yīng)研究尚屬空白；（3）現(xiàn)有研究主要集中于基因組DNA甲基化水平與基因表達(dá)量的相關(guān)性分析，而DNA甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制尚不明確；（4）重要的是，如何有效運用經(jīng)典遺傳學(xué)和CRISPR/dCas9體系探索DNA甲基化修飾對候選基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制一直是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點和難點。

竹子在保障木材安全、加速生態(tài)文明建設(shè)和助力鄉(xiāng)村振興等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，但基礎(chǔ)研究相對薄弱；相對于其他竹種，毛竹的遺傳背景和基因組信息比較豐富，是基礎(chǔ)研究中非常有價值的研究材料。以毛竹及其突變體樣本為材料，明確野生型及其突變體在形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及DNA甲基化模式方面的變異規(guī)律，并分析其相關(guān)性；解釋DNA甲基化在組織分化和發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；利用基因組編輯技術(shù)，解析DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的分子生物學(xué)功能。以上研究將為禾本科特別是竹類植物精準(zhǔn)育種提供理論指導(dǎo)與技術(shù)支持。