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    利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建MDH2敲除細(xì)胞株及抗嘔吐毒素效應(yīng)研究

    2023-08-15 08:30:10施煒濤姚春鵬魏文康王蕾房元杰仝鈺潔馬曉姣蔣文張曉愛邵偉
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:孔板毒素測(cè)序

    施煒濤 姚春鵬 魏文康 王蕾 房元杰 仝鈺潔 馬曉姣 蔣文張曉愛 邵偉

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心 廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)

    嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),屬于B型單端孢霉烯族毒素,作為一種廣泛存在于谷物和動(dòng)物飼料以及食品中的真菌毒素,可由禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌等多種鐮刀菌產(chǎn)生[1-2]。受到霉菌污染的玉米、小麥、大豆等飼料原料及青貯飼料中均存在不同濃度的DON[3-4]。在對(duì)陜西、新疆、甘肅和寧夏4省收獲的小麥進(jìn)行DON含量及流行率檢測(cè),結(jié)果顯示82.9%的樣品受到DON污染,平均濃度達(dá)500 μg/kg,根據(jù)我國(guó)規(guī)定的DON標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2017),其中10%的陽(yáng)性樣品超過1 000 μg/kg的最大限值[1]。對(duì)多地的飼料及原料取樣監(jiān)測(cè)分析,其中玉米及其副產(chǎn)品均有不同程度的DON污染[5]。一份對(duì)豬飼料樣品的霉菌毒素含量檢測(cè)報(bào)告顯示,DON在不同品種豬飼料中含量普遍偏高,其中空懷母豬料和育肥料中DON含量高于國(guó)家規(guī)定[6]。

    DON屬于劇毒或中等毒物的范疇,對(duì)人和動(dòng)物具有廣泛的毒性效應(yīng),具體表現(xiàn)為嘔吐、炎癥、消化道出血,甚至死亡[7-8]。豬是對(duì)DON最敏感的動(dòng)物之一,其次為小鼠、大鼠、家禽和反芻動(dòng)物[9]。DON不僅對(duì)豬腸道具有局部毒性,而且會(huì)導(dǎo)致許多腸道功能失調(diào)并削弱免疫反應(yīng),減少采食量和體重增加[10]。攝入含DON的飼料時(shí),豬的腸道會(huì)出現(xiàn)絨毛頂端壞死、多灶性萎縮和絨毛融合、固有層水腫、腸細(xì)胞胞漿空泡化、十二指腸絨毛高度降低和腸道細(xì)胞溶解等情況[11]。而當(dāng)飼料中同時(shí)存在嘔吐毒素和其他霉菌毒素如鐮刀菌酸時(shí),相互之間會(huì)產(chǎn)生協(xié)同和相加效應(yīng),混合物整體的毒性增強(qiáng),出現(xiàn)嘔吐、拒食、生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象[12-16]。

    近年來已報(bào)道多個(gè)與DON毒性有關(guān)的基因,王海飛等[16]利用CRISPR/Cas9敲除文庫(kù)篩選到THEM5等DON抗性重要候選基因。許寫等[17]通過構(gòu)建了穩(wěn)定干擾METTL3基因表達(dá)水平的IPEC-J2細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)降低該基因的表達(dá)水平可以抵抗由DON誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和炎癥。Xu等[18]研究報(bào)道SLC4A11和MFSD3基因的過表達(dá)能夠增強(qiáng)DON處理下IPEC-J2細(xì)胞的活力。

    蘋果酸脫氫酶2(MDH2)是線粒體中三羧酸循環(huán)(TCA)的關(guān)鍵酶之一,利用催化H+從蘋果酸的羥基轉(zhuǎn)移至NAD+上,以實(shí)現(xiàn)蘋果酸和草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)化,在乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖的發(fā)生和氧化/還原平衡等代謝途徑也發(fā)揮重要作用。MDH2以二聚體形式存在,單體分子量35.6 kD左右,包含5個(gè)NAD+結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)質(zhì)子結(jié)合位點(diǎn)[19]。已有研究報(bào)道MDH2與癌癥有密切聯(lián)系,MDH2能夠通過抑制PTEN增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]。刺激MDH2能夠激活A(yù)KT通路,從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的轉(zhuǎn)移和侵襲[21]。在前列腺癌細(xì)胞中也檢測(cè)到MDH2的表達(dá)升高[22]。此外,MDH2被確定為是嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤的易感基因[23]。但目前尚未報(bào)道MDH2和毒素之間的存在聯(lián)系。

    前期我們利用CRISPR文庫(kù)篩選了嘔吐毒素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),MDH2是候選基因之一。但目前對(duì)于MDH2基因?qū)τ贒ON的影響在國(guó)內(nèi)外期刊中并沒有相關(guān)報(bào)道,因此本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建豬MDH2基因穩(wěn)定敲除的IPEC-J2細(xì)胞株,并檢測(cè)了MDH2基因抗DON毒性效應(yīng)的影響,為后續(xù)深入探究MDH2基因?qū)ON的毒性作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。MDH2基因后續(xù)可以作為抗DON的靶標(biāo),基因敲除或針對(duì)該靶標(biāo)開發(fā)相關(guān)藥物,可降低DON對(duì)腸道細(xì)胞的損傷以及對(duì)人和動(dòng)物的毒性,在醫(yī)療和畜牧業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    IPEC-J2細(xì)胞系由本研究室保存;嘔吐毒素和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司;pSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0質(zhì)粒購(gòu)自淼靈生物科技有限公司;P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Lonza公司;T4連接酶、T4 PNK、10×T4連接緩沖液、限制性核酸內(nèi)切酶BbsI購(gòu)自New England Biolabs公司;大腸桿菌E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京金沙生物科技有限公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生物公司;胎牛血清FBS、胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、嘌呤霉素購(gòu)自Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自Hyclone公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自Procell公司;通用型RNA提取試劑盒購(gòu)自艾科瑞生物技術(shù)有限公司;一抗Anti-MDH2購(gòu)自HUABIO公司;Anti-Tubulin購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;二抗Goat Anti-Mouse IgG(H+L)HRP和Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP購(gòu)自Affinity 公司;動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司;CCK8(cell counting kit-8)試劑盒購(gòu)自Apexbio公司;YO-PRO-1/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DMEM/F12完全培養(yǎng)基包含10%FBS和1%雙抗,IPEC-J2細(xì)胞接種于25 cm2底面積培養(yǎng)瓶中,放在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

    1.2.2 DON的配制 用DMSO將DON粉末溶解,用0.22 μm濾膜過濾,配成5 mg/mL母液。再分別用DMEM/F12完全培養(yǎng)基配成濃度分別為4、2、1和0.5 μg/mL的DON溶液,整個(gè)過程在生物安全柜中完成。

    1.2.3 豬MDH2基因sgRNA的設(shè)計(jì) 針對(duì)豬源MDH2基因(NCBI Gene ID: 397039)使用CRISPR DESIGN(http://crispr.mit.edu)網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì),根據(jù)評(píng)分選取位于外顯子9126-9203區(qū)域的sgRNA。并在sgRNA的5'端添加CACCG,形成正向Oligo DNA(sgRNA-MDH2-F),在反向Oligo DNA(sgRNAMDH2-R)的3'端添加C,在5'端添加AAAC(表1)。

    表1 MDH2靶向位點(diǎn)及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 MDH2 targeting sites and sgRNA oligonucleotide sequences

    1.2.4 豬MDH2基因編輯載體的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選 首先將以上正鏈Oligo DNA(sgRNAMDH2-F)和負(fù)鏈Oligo DNA(sgRNA-MDH2-R)退火形成dsDNA,反應(yīng)體系:正負(fù)鏈Oligo DNA各1 μL,10×T4 連接緩沖液1 μL,T4 PNK 0.5 μL,補(bǔ)H2O至10 μL,離心后置于PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)(37℃ 30 min;95℃ 5 min)。取退火后形成的dsDNA與PX459載體連接,酶切與連接反應(yīng)體系:PX459質(zhì)粒模板25 ng,dsDNA和10×T4連接緩沖液各1 μL,BbsI和T4連接酶各0.5 μL,加入ddH2O補(bǔ)至10 μL體系,各成分離心后置于PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)(37℃ 5 min;23℃ 5 min,25循環(huán))。

    放置連接產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞混合物于冰上30 min后42℃水浴熱擊90 s,經(jīng)過冰浴冷卻5 min后,加入普通的LB液體培養(yǎng)基,置于37℃振蕩培養(yǎng)1 h,使細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒編碼的Amp抗性基因并恢復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài);將菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)平板上,將培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。用含Amp的LB液體培養(yǎng)基對(duì)挑取的若干單菌落擴(kuò)大培養(yǎng),并提取質(zhì)粒送至生工使用U6啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.5 基因編輯載體的轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素的篩選 用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí),用胰酶將細(xì)胞消化下來,使用Lonza電轉(zhuǎn)儀將上述構(gòu)建的基因編輯載體導(dǎo)入細(xì)胞核中。用濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基連續(xù)篩選7 d,每2 d更換新鮮的含嘌呤霉素完全培養(yǎng)基,同時(shí)以IPEC-J2細(xì)胞作為對(duì)照組進(jìn)行觀察。待對(duì)照組完全死亡后用胰酶將存活的混合克隆細(xì)胞群消化下來,使用有限稀釋法稀釋成單克隆細(xì)胞于96孔板中。

    1.2.6 單克隆細(xì)胞的篩選 待96孔板中的單克隆細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)至一定數(shù)量,轉(zhuǎn)移至24孔板中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng),再進(jìn)一步擴(kuò)大至6孔板中,提取細(xì)胞的基因組DNA,設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行高保真PCR,將PCR產(chǎn)物送至生工進(jìn)行測(cè)序。引物序列請(qǐng)見表2。

    表2 MDH2基因PCR測(cè)序引物Table 2 Primers for PCR sequencing of MDH2 gene

    1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中MDH2基因的表達(dá)水平 提取野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞的RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入到熒光定量PCR 96孔板之中,使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,94℃預(yù)變性30 s;94℃變性5 s、57℃退火15 s、72℃延伸10 s并收集熒光信號(hào),共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)計(jì)5復(fù)孔,并以β-actin作為參照基因,用相對(duì)定量法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。引物序列請(qǐng)見表3。

    表3 MDH2基因RT-qPCR引物Table 3 RT-qPCR primers for MDH2 gene

    1.2.8 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中MDH2蛋白的表達(dá)水平 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞分別培養(yǎng)于六孔板中,等待長(zhǎng)滿全孔后棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗兩遍后使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,冰上孵育10 min后離心取上清,加入上樣buffer,100℃煮樣10 min獲得蛋白樣品。對(duì)照組和試驗(yàn)組分別各取15 μg蛋白樣品通過10%的電泳膠進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉后,TBST洗去剩余奶粉,一抗Anti-MDH2(1∶1 000稀釋)于4℃孵育過夜,TBST洗膜4次,每次20 min。用1∶6 000稀釋的二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP與膜在室溫下孵育1 h,TBST洗膜4次,每次20 min。顯影液漂洗后用化學(xué)發(fā)光儀顯色拍照,以Tubulin為內(nèi)參蛋白。

    1.2.9 MDH2-KO在DON處理后的細(xì)胞活力測(cè)定 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞以每孔2×104的密度接種96孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞生長(zhǎng)到合適密度,每孔加入不同DON濃度的完全培養(yǎng)基。每組加入等量100 μL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON濃度的完全培養(yǎng)基,每組濃度復(fù)5孔,充分混勻板中各孔的液體。第3天更換一次含不同濃度DON的完全培養(yǎng)基,并每天觀察細(xì)胞狀態(tài),在37℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

    用CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞活力,在96孔板中選取5個(gè)無細(xì)胞孔,每孔加入100 μL DMEM/F12完全培養(yǎng)基,以獲得背景發(fā)光值。向96孔板中有液體的每個(gè)孔中加入10 μL CCK8試劑溶液,將96孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm處的OD值。

    細(xì)胞活力計(jì)算公式:

    細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD-背景值OD)/(對(duì)照組OD-背景值OD)×100%

    1.2.10 MDH2-KO在DON處理后細(xì)胞死亡率檢測(cè) 野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞接種于六孔板培養(yǎng)板中,置于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到合適密度,每孔更換為等量2 mL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON的完全培養(yǎng)基,第3天更換一次含不同DON濃度的完全培養(yǎng)基,共處理5 d。

    將對(duì)照組和試驗(yàn)組貼壁細(xì)胞用15%胰酶消化后用完全培養(yǎng)液重懸,并用PBS洗滌一次。對(duì)于上一步驟的每個(gè)沉淀加入500 μL YP1/PI檢測(cè)工作液,并重懸為單細(xì)胞懸液。放入37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。準(zhǔn)備僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照,該緩沖液與配制YP1/PI檢測(cè)工作液的緩沖液宜保持一致。同時(shí)準(zhǔn)備YP1和PI的單染樣品用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。孵育完成后,可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(YP1染色陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光,Ex/Em=491/509 nm;PI染色陽(yáng)性細(xì)胞為紅色熒光,Ex/Em=535/617 nm),整個(gè)過程均需避光操作。將染色后的樣品置于冰上,并在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。

    2 結(jié)果

    2.1 MDH2基因編輯載體的構(gòu)建

    合成的sgRNA單鏈經(jīng)退火形成雙鏈,將其與PX459空載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsbI酶切后的線性載體片段連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒。從載體U6啟動(dòng)子后開始測(cè)序,結(jié)果顯示插入PX459載體的堿基序列與設(shè)計(jì)的sgRNA序列完全一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,測(cè)序結(jié)果如圖1所示,命名為PX459-sgRNA-MDH2。

    圖1 重組質(zhì)粒PX459-sgRNA-MDH2測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing peak of recombinant plasmid PX459-sgRNA-MDH2

    2.2 MDH2-KO細(xì)胞株的構(gòu)建與驗(yàn)證

    通過單克隆稀釋和擴(kuò)大培養(yǎng),并挑選10株單克隆細(xì)胞提取基因組DNA,將通過高保真PCR所得產(chǎn)物送至公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示其中一株為單峰(圖2),且與野生型MDH2基因(圖3)相比缺失5 bp堿基(圖4),這種缺失突變可導(dǎo)致基因開放閱讀框改變、翻譯提前終止。與IPEC-J2野生型細(xì)胞株相比,該細(xì)胞株的mRNA表達(dá)水平顯著降低,且組內(nèi)mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。單克隆細(xì)胞蛋白樣品的Western blot鑒定結(jié)果見圖5-B,與野生型IPEC-J2細(xì)胞相比,篩選得到的細(xì)胞株中MDH2蛋白表達(dá)水平幾乎完全喪失。結(jié)合基因組PCR產(chǎn)物測(cè)序及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為該單克隆細(xì)胞系中目的基因被完全敲除且為單克隆,命名MDH2-KO。

    圖2 MDH2-KO細(xì)胞系CRISPR靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2-KO cell line

    圖3 MDH2野生型IPEC-J2細(xì)胞系CRISPR靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.3 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2 wild-type IPEC-J2 cell line

    圖4 野生型IPEC-J2細(xì)胞與MDH2-KO序列比對(duì)圖Fig.4 Sequence comparison of wild-type IPEC-J2 cells with MDH2-KO

    2.3 MDH2基因的敲除對(duì)IPEC-J2抗嘔吐毒素毒性效應(yīng)的影響

    2.3.1 CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDH2基因的敲除提高DON處理后的細(xì)胞活力 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞系分別以每孔2×104的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,用嘔吐毒素(4、2、1和0.5 μg/mL)處理5 d后,用CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞活力。發(fā)現(xiàn)MDH2-KO細(xì)胞系與野生型IPEC-J2細(xì)胞相比,在DON濃度為4、2、1和0.5 μg/mL的條件下細(xì)胞活力分別極顯著提高18.67%(***P< 0.001)、19.59%(***P< 0.001)、26.36%(***P< 0.001)和27.01%(***P< 0.001)(圖6)。表明敲除MDH2基因后可增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)嘔吐毒素的耐受性。

    2.3.2 流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDH2基因的敲除降低DON處理后的細(xì)胞死亡率 不同濃度DON對(duì)IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞的死亡率影響結(jié)果如圖7所示,經(jīng)過YP1/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè),正常活細(xì)胞為Q4區(qū)域(YP1-/PI-),凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染為綠色位于Q3區(qū)域(YP1+/PI-),壞死細(xì)胞的細(xì)胞核被染為紅色位于Q1和Q2區(qū)域(YP1-/PI+和YP1+/PI+)。與野生型細(xì)胞相比,敲除MDH2使不同濃度DON(4、2、1和0.5 μg/mL)作用5 d條件下細(xì)胞死亡率分別極顯著降低30.33%(***P< 0.001)、15.81%(***P< 0.001)、16.00%(***P< 0.001)和14.7%(***P< 0.001)。表明敲除MDH2基因后可增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)嘔吐毒素的抗性。

    圖7 流式檢測(cè)DON處理后IPEC-J2和MDH2-KO的細(xì)胞死亡率Fig.7 Flow assay of cell mortality of IPEC-J2 and MDH2-KO after DON treatment

    3 討論

    本研究表明MDH2在DON誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡毒性中發(fā)揮重要作用。DON毒性機(jī)制包括:誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧(ROS)和活性氮(RNS)積累引起氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化,破壞DNA結(jié)構(gòu)[24];促進(jìn)凋亡蛋白Caspase家族表達(dá)引起細(xì)胞凋亡[25];與rRNA結(jié)合后激活p38、JNK、ERK1/2、MAPKS等信號(hào)通路抑制蛋白質(zhì)合成影響細(xì)胞功能[26]。許多研究發(fā)現(xiàn)DON處理后細(xì)胞的ROS水平提高,與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)增加[27-28]。而由DON處理提高的ROS會(huì)破壞線粒體膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致通透性增加,凋亡因子Cyt-c釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),并激活下游Caspase凋亡蛋白家族,引發(fā)細(xì)胞凋亡[29]。此外,DON對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用與NF-κB/HIF-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),并以劑量依賴的方式顯著增加HIF-1α的表達(dá)[30]。

    MDH2既在能量代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,也與細(xì)胞死亡調(diào)控有密切聯(lián)系。MDH2作為TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶利用NAD-NADH輔酶系統(tǒng)催化蘋果酸可逆地氧化為草酰乙酸,產(chǎn)生的NADH作為氧化磷酸化的還原當(dāng)量,是細(xì)胞ATP生物合成、耗氧的基本過程,但同時(shí)也能為mETC提供電子誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生并啟動(dòng)細(xì)胞死亡過程[31-35]。Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)敲除MDH2基因能夠顯著降低蘋果酸處理后HeLa細(xì)胞中的ROS水平和細(xì)胞凋亡,表明MDH2在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用。Wang等[37]報(bào)道了MDH2基因的突變會(huì)阻止Caspase-3活化和果蠅幼蟲唾液腺細(xì)胞死亡,并導(dǎo)致細(xì)胞的ATP水平降低。抑制MDH2可降低腎小管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧狀態(tài)下HIF-1α水平和氧化應(yīng)激,并減少細(xì)胞凋亡和鐵性細(xì)胞死亡,表明MDH2也可以通過調(diào)控HIF-1α相關(guān)的信號(hào)途徑來調(diào)控細(xì)胞死亡[38]。

    綜上可見,DON與MDH2在調(diào)控細(xì)胞死亡方面存在共同的信號(hào)途徑,本研究揭示了MDH2基因的敲除賦予IPEC-J2細(xì)胞抗嘔吐毒素的能力,能減少嘔吐毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。我們推測(cè)MDH2基因的敲除可能通過降低ROS的水平、抑制Caspase凋亡蛋白和下調(diào)HIF-1α的表達(dá),從而減少細(xì)胞死亡降低嘔吐毒素對(duì)細(xì)胞的毒性。而MDH2基因在這些途徑中具體發(fā)揮哪些功能還需進(jìn)一步深入研究。

    4 結(jié)論

    本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功制備出豬MDH2基因敲除的IPEC-J2單克隆細(xì)胞系,并通過細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡檢測(cè),證明敲除MDH2基因能使細(xì)胞具有抗嘔吐毒素毒性效應(yīng)的能力。

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