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    植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的研究進(jìn)展

    2023-08-15 08:29:48李宇李素貞陳茹梅盧海強(qiáng)
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:亞族缺鐵擬南芥

    李宇 李素貞 陳茹梅 盧海強(qiáng)

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,保定 071000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081)

    鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素,其作為重要的輔因子在植物體的各種重要的代謝過(guò)程中發(fā)揮作用,如光合作用、呼吸作用、荷爾蒙的合成及固氮作用等[1]。植物缺鐵會(huì)帶來(lái)產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問(wèn)題,嚴(yán)重缺乏時(shí)甚至?xí)?dǎo)致作物絕產(chǎn)[2]。植物中鐵過(guò)量也會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)造成危害,鐵在植物體內(nèi)過(guò)量積累會(huì)引起鐵中毒,表現(xiàn)為生理代謝失調(diào)、生長(zhǎng)發(fā)育受阻。因此,植物中鐵的攝取與平衡必須受到嚴(yán)格的控制,來(lái)滿(mǎn)足其生長(zhǎng)供應(yīng)與需求。

    鐵在土壤中的含量豐富,植物可以從土壤中獲得鐵,但是植物從土壤中攝取鐵的能力是有限的,主要原因是鐵以三價(jià)鐵及磷酸鹽形式存在,在堿性土壤中尤為明顯。植物應(yīng)答缺鐵條件形成了兩種鐵的吸收機(jī)制:機(jī)制I和機(jī)制Ⅱ[3-4]。機(jī)制I和機(jī)制Ⅱ的主要區(qū)別是機(jī)制I吸收Fe2+,而機(jī)制Ⅱ是以螯合的策略吸收Fe3+。雙子葉植物及非禾本科單子葉植物利用機(jī)制I吸收鐵,禾本科植物利用機(jī)制Ⅱ吸收鐵[5]。機(jī)制I植物吸收鐵的主要過(guò)程:植物先向根際分泌酚類(lèi)物質(zhì)或氫離子來(lái)酸化土壤增加鐵的溶解性[6],隨后鐵還原酶FRO(Fe3+-chelate reductase)基因?qū)e3+還原為Fe2+,最后通過(guò)Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1/IRT2(iron-regulated transporter)[7]將其轉(zhuǎn)運(yùn)至植物體內(nèi)細(xì)胞以滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)發(fā)育需要[8]。機(jī)制Ⅱ是基于螯合策略,首先在植物根細(xì)胞中經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成麥根酸類(lèi)物質(zhì)PS(phytosiderophores),麥根酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TOM1(transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1)將PS轉(zhuǎn)運(yùn)至根際,與土壤中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復(fù)合物,黃色條紋蛋白YSL(yellow stripe)將Fe3+-PS螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[9]。兩種機(jī)制均由復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)調(diào)控,這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由多種轉(zhuǎn)錄因子組成,其中堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH(basic halix-loop-halix)家族的成員發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。

    本文以依賴(lài)兩種不同鐵吸收策略調(diào)控體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的擬南芥和水稻為例,對(duì)二者中的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)作用中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)、討論,以期能夠提高我們對(duì)植物控制鐵元素動(dòng)態(tài)平衡這一復(fù)雜機(jī)制的理解。

    1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

    bHLH家族是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,亞族豐富[11],擬南芥、水稻中的所有bHLH家族成員可分為32個(gè)亞族,其中擬南芥中包含的bHLH家族成員有162個(gè),水稻中包含167個(gè)[12]。

    bHLH蛋白是一個(gè)真核轉(zhuǎn)錄因子家族,調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化和發(fā)育有關(guān)的一系列基因的表達(dá)[13]。bHLH家族以其高度保守的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域命名,bHLH結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成,分為兩個(gè)區(qū)域,一個(gè)是堿性區(qū),通常由13-17個(gè)氨基酸組成,位于氨基酸序列的N端,負(fù)責(zé)二聚化和參與DNA與E-box序列的結(jié)合[14];另一個(gè)是由近40個(gè)氨基酸組成的HLH區(qū)域,位于氨基酸序列的C端,由兩個(gè)含有疏水殘基的α螺旋組成(圖1),需要二聚化來(lái)調(diào)控參與各種信號(hào)通路的靶基因的表達(dá)[15-16]。對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征的了解能幫助我們更好地理解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵缺乏基因的表達(dá)機(jī)理。

    圖1 鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要蛋白bHLH結(jié)構(gòu)域Fig.1 Alignment of the bHLH domain of iron-regulated network main proteins

    2 植物中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究現(xiàn)狀

    2.1 擬南芥中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族

    2.1.1 機(jī)制I的BTS感受器通路 擬南芥是典型的模式植物之一,利用機(jī)制I吸收鐵,并且bHLH家族成員在擬南芥中研究得比較多,尤其是參與缺鐵脅迫應(yīng)答的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。到目前為止,在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有屬于6個(gè)亞族的17個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與鐵的平衡調(diào)節(jié)[17-18],在應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫時(shí),同一亞族的轉(zhuǎn)錄因子往往發(fā)揮著相似的功能。

    擬南芥缺鐵反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游是E3連接酶基因BTS(brutus),BTS受缺鐵強(qiáng)烈誘導(dǎo),是一種潛在的鐵傳感器,對(duì)鐵離子高度敏感,其能與鐵結(jié)合并且具有泛素化轉(zhuǎn)錄因子的功能[19]。在擬南芥以及其他一些雙子葉植物中,還存在著兩個(gè)與BTS部分功能冗余的E3泛素連接酶,BTSL1(Brutus-like 1)和BTSL2,C末端結(jié)構(gòu)域具有E3連接酶活性,在擬南芥體內(nèi)能促進(jìn)類(lèi)缺鐵所誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH29/FIT(fer-like Fe deficiency-induced transcription factor)的降解。BTSL1和BTSL2之間也存在相互協(xié)同調(diào)節(jié),但不與BTS之間關(guān)聯(lián)[20]。BTS缺鐵響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,與參與鐵信號(hào)傳導(dǎo)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族IVc亞族的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子bHLH34、bHLH104、bHLH105/ILR3(iaa leucine resistant 3)和bHLH115直接相互作用,靶向IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子在富鐵植物中降解,負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的吸收,這對(duì)于防止過(guò)量鐵攝取至關(guān)重要[21]。

    在對(duì)IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),在根中缺鐵時(shí),除了ILR3,AtbHLH115、AtbHLH104和AtbHLH34也都被證明是鐵吸收的正調(diào)控因子,而ILR3和bHLH104是最關(guān)鍵的IVc轉(zhuǎn)錄因子亞族,相比較來(lái)說(shuō),bHLH115起到的作用較小,bHLH34似乎不參與地上部缺鐵反應(yīng)[22]。bhlh115表現(xiàn)出對(duì)缺鐵的敏感性,而bHLH115的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了鐵的積累,這表明bHLH115正向調(diào)控鐵缺乏反應(yīng)基因的表達(dá)[23]。bHLH104/105或bHLH34/105的同源或異源二聚體發(fā)揮著非冗余調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的作用,直接參與bHLH47/PYE(popeye)的調(diào)控[24]。bHLH34和bHLH104功能缺失的突變體中發(fā)生鐵缺乏反應(yīng)的中斷和植物體內(nèi)鐵含量減少的情況,而過(guò)表達(dá)植物則促進(jìn)了鐵缺乏反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)以及增加了植株鐵的積累量[23]。Li等[12]進(jìn)一步分析表明,每一個(gè)IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員都可以直接激活下游Ib亞族基因bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄,它們擁有相似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明bHLH IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子與bHLH121/URI(upstream regulator of IRT1)相互作用,并能夠促進(jìn)其在細(xì)胞核的積累,共同激活I(lǐng)b亞族基因轉(zhuǎn)錄[25-26]。

    研究發(fā)現(xiàn)bHLH121功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥嚴(yán)重的鐵缺乏癥狀,減少擬南芥體內(nèi)鐵的積累量,并擾亂與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)。過(guò)表達(dá)FIT有助于提高bhlh121的存活率。而且bHLH121具有DNA結(jié)合活性,可以與FIT和bHLH Ib基因的啟動(dòng)子結(jié)合,但未發(fā)現(xiàn)它對(duì)這些基因具有直接的轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性。bHLH121在bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子下游發(fā)揮作用,是bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子的直接靶點(diǎn),其表達(dá)受缺鐵誘導(dǎo),且依賴(lài)于bHLH IVc[17]。這些結(jié)果均表明,bHLH121與bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子一起正向調(diào)節(jié)FIT的表達(dá),在維持?jǐn)M南芥中鐵的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    遺傳分析表明,F(xiàn)IT是bHLH121的下游靶基因,屬于IIIa亞族,是擬南芥缺鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心轉(zhuǎn)錄因子[27]。FIT在根表皮受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá),fit表現(xiàn)出黃化表型,缺鐵時(shí)fit幼苗無(wú)法存活,約一半的缺鐵誘導(dǎo)基因在其根中表達(dá)下調(diào),而鐵吸收關(guān)鍵基因FRO2和鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1(iron-regulated transporter 1)的表達(dá)量顯著降低[28],這說(shuō)明FIT對(duì)于擬南芥缺鐵應(yīng)答的調(diào)節(jié)是必需的。

    在酵母細(xì)胞中表達(dá)FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101中的任何一個(gè)可激活FRO2和IRT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)[29],這表明FIT能與bHLH38/39/100/101中的任何一個(gè)形成異源二聚體直接調(diào)控FRO2和IRT1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)二價(jià)鐵的吸收。而進(jìn)一步的分析表明,F(xiàn)RO2和IRT1在轉(zhuǎn)錄水平上不受調(diào)控,因?yàn)樵谌辫F條件下FIT過(guò)表達(dá)植株中都檢測(cè)到了IRT1蛋白的積累和較高的FRO2的活性。與野生型相比過(guò)表達(dá)FIT和AtbHLH38/AtbHLH39的植株在地上部積累了更多的鐵[30]。以上這些結(jié)果表明FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101互作形成異源二聚體來(lái)正調(diào)控下游的FRO2和IRT1,以促進(jìn)擬南芥等機(jī)制I植物吸收鐵。在擬南芥中的突變研究表明,Ib bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞族的成員bHLH100和bHLH101在功能上是冗余的,但它們可能通過(guò)激活不同的下游基因來(lái)調(diào)節(jié)鐵缺乏的反應(yīng)[15],bHLH38和bHLH39也是這樣[16],bHLH38/39與bHLH100/101之間盡管非常相似,但是它們之間仍存在著非冗余的功能。

    PYE是根中柱鞘細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的缺鐵響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子。Long等[31]對(duì)PYE的功能分析表明,在缺鐵條件下,PYE對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有正向調(diào)節(jié)作用。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PYE能夠通過(guò)直接結(jié)合到煙酰胺合成酶NAS4(nicotianamine synthase 4)、FRO3、鋅誘導(dǎo)的促進(jìn)因子ZIF1(zincinduced facilitator 1)的啟動(dòng)子上,并下調(diào)其表達(dá)。PYE與bHLH104/105/115互作,下調(diào)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因。通過(guò)CHIP-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,bHLH115直接激活bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄,這表明bHLH34、AtbHLH104、bHLH105和bHLH115均參與了PYE調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在擬南芥鐵穩(wěn)態(tài)的維持中起著關(guān)鍵作用。

    bHLH11也是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)控因子,定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,隨著鐵缺乏的增加而表達(dá)量降低。共表達(dá)分析表明,IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)了bHLH11的核積累。進(jìn)一步分析表明,bHLH11抑制了IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Ib亞族基因(bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101)的調(diào)控。bHLH11還作為FIT的負(fù)調(diào)控因子,抑制FIT在擬南芥中的表達(dá)[32]。這些結(jié)論表明bHLH11可以使植物避免鐵攝取過(guò)量而導(dǎo)致的鐵中毒問(wèn)題。

    2.1.2 機(jī)制I的植物激素信號(hào)通路 FIT作為擬南芥中響應(yīng)缺鐵脅迫網(wǎng)絡(luò)中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,參與多種響應(yīng)缺鐵信號(hào)通路的調(diào)節(jié),是這些信號(hào)的調(diào)節(jié)中心。在調(diào)控鐵吸收過(guò)程中,大部分的FIT是以非活性的形式存在,只有小部分FIT被磷酸化,感知環(huán)境中鐵的增加[33]。在缺鐵條件下,植物體內(nèi)的Ca2+濃度增加,作為第二信使被類(lèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶b亞基蛋白CBL1(calcineurin-B-like Ca2+sensor protein 11)或CBL9檢測(cè)到,激活Ca2+誘導(dǎo)的絲氨酸蛋白激酶CIPK11(cbl-interacting protein kinase 11)將FIT-C端的Ser272處磷酸化,激活大量的FIT,并且這一位點(diǎn)的磷酸化會(huì)促進(jìn)FIT和Ib異源二聚體的形成,激活下游缺鐵響應(yīng)基因。FIT還存在另一種磷酸化,就是在Tyr237和Tyr238的磷酸化,會(huì)對(duì)FIT活性產(chǎn)生負(fù)面影響,導(dǎo)致FIT向細(xì)胞核的遷移率降低,與bHLH39的相互作用減少,這也是一個(gè)調(diào)節(jié)FIT活性的方式[34]。

    在擬南芥中,存在茉莉酸JA(jasmonic acid)對(duì)缺鐵脅迫的多重抑制。JA信號(hào)通路已知的主要調(diào)控因子是IIIe亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的bHLH6/MYC2(myelocytomatosis proteins)。在JA存在的情況下,MYC2導(dǎo)致IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子(bHLH18、bHLH19、bHLH20和bHLH25)的表達(dá)上調(diào)[35]。這4個(gè)功能相似的轉(zhuǎn)錄因子主要在根中表達(dá),并且都與FIT相互作用,調(diào)節(jié)FIT蛋白的積累。目前的相關(guān)研究還未提出FIT與IVa亞族的這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子形成的異源二聚體在植物鐵缺乏調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游靶基因是哪些,僅指出了FIT與IVa亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用會(huì)導(dǎo)致FIT的26s蛋白酶體降解,而FIT與Ib亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的相互作用則會(huì)促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性,這就使得IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子和Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子在與FIT的結(jié)合之間存在著一種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,前者促進(jìn)FIT降解,而后者促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性。

    赤霉素GA(gibberellin)是另外一類(lèi)植物生長(zhǎng)激素,已被證實(shí)在鐵缺乏反應(yīng)中發(fā)揮作用[36]。研究發(fā)現(xiàn),在缺鐵條件下,使用GA4處理后的赤霉素缺失突變體,其IRT1、FRO2、bHLH038和bHLH39(后兩者控制IRT1和FRO2表達(dá))的表達(dá)量顯著提高,但是FIT的表達(dá)不受GA4誘導(dǎo)。這表明GA在缺鐵條件下對(duì)鐵吸收相關(guān)基因的誘導(dǎo)是依賴(lài)FIT的。GA信號(hào)通過(guò)DELLA蛋白參與缺鐵反應(yīng),酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像(FRET-FLIM)和免疫共沉淀(Co-IP)分析表明,GA信號(hào)的DELLA阻遏蛋白可以與FIT、bHLH38和bHLH39蛋白形成異二聚體。FRET-FLIM和EMSA結(jié)果顯示,DELLA-FIT異源二聚體并不阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體,而是通過(guò)阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的異源二聚體與其靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)抑制FIT的轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)綠色熒光蛋白幼苗的芯片分析表明,在缺鐵條件下,在DELLA蛋白存在的情況下,F(xiàn)IT與其目標(biāo)基因啟動(dòng)子的相互作用減少[37]。在缺鐵條件下,DELLA蛋白在根分生組織中積累,最終使FIT與Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體的形成以及激活鐵攝取基因。

    EIN3(ethylene insensitive 3)和EIL1(EIN3-like 1)是兩個(gè)通過(guò)乙烯信號(hào)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子[38]。二者均可以和FIT相互作用,促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性,從而增加鐵攝取基因的表達(dá)。乙烯信號(hào)通路的EIN3或是EIL1并不影響FIT和Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控,二者均可以抑制FIT被蛋白酶體降解,通過(guò)促進(jìn)FIT的穩(wěn)定性來(lái)增強(qiáng)鐵的獲取[39]。MED16(mediator subunit 16)是中介體復(fù)合物的一個(gè)亞單位,連接異源二聚體的RNA聚合酶II(Pol II)復(fù)合體, 提高FIT/ Ib bHLH二聚體與FRO2和IRT1啟動(dòng)子結(jié)合的穩(wěn)定性,向RNA聚合酶2傳輸信號(hào),激活FRO2和 IRT1表達(dá)[40]。MED16與另一個(gè)亞基MED25(mediator subunit 25)相互作用,MED25通過(guò)與EIN3和EIL1的相互作用,在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[41]。

    關(guān)于機(jī)制I植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)研究得相對(duì)比較清楚,不論是缺鐵情況下還是生長(zhǎng)在富鐵的肥沃土壤中,植物中都有相應(yīng)功能的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮作用,這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成一張復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)(圖2),精準(zhǔn)地調(diào)控鐵的吸收和運(yùn)輸,使植物體內(nèi)的鐵積累量始終維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的狀態(tài),為植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育保駕護(hù)航。

    圖2 擬南芥中鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控Fig.2 Fe homeostasis regulation in Arabidopsis

    圖3 擬南芥和水稻中調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of bHLH TFs regulating Fe homeostasis in Arabidopsis and rice(Oryza sativa)

    2.2 水稻中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子

    水稻由于其生長(zhǎng)條件可以是淹水,也可以土培,所以是鐵吸收完整的機(jī)制Ⅱ與部分機(jī)制I同時(shí)存在[42],bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控水稻機(jī)制Ⅱ鐵的吸收及機(jī)制I與機(jī)制Ⅱ鐵的運(yùn)輸。與擬南芥相比,水稻中現(xiàn)已被研究的鐵運(yùn)輸調(diào)控相關(guān)bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子較少,但水稻中的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子大多與擬南芥中的為同源基因,處在同樣的亞族位置(圖3),在水稻中發(fā)揮著與擬南芥中相似的功能。

    OsHRZ1(hemerythrin motif-containing really interesting new gene and zinc-finger protein 1)與擬南芥中的BTS同源,類(lèi)似地,OsHRZ1通過(guò)26S蛋白酶途徑靶向OsPRI1(positive regulator of iron homeostasis 1)[43]。hrz1相比野生型對(duì)照對(duì)鐵缺乏的耐受性更強(qiáng),Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,隨著OsHRZ1-GFP含量的增加,OsPRI1蛋白豐度降低,這些結(jié)果表明了OsHRZ1在鐵充足的條件下通過(guò)泛素化OsPRI1負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的穩(wěn)態(tài)[44]。比較分析表明,OsPRI1的氨基酸序列與IVc亞族的AtbHLH34/104/105/115相似,與AtbHLH34/104/105/115正調(diào)控AtbHLH38/39/100/101一樣,OsPRI1直接上調(diào)OsIRO2的表達(dá)進(jìn)而激活鐵吸收相關(guān)基因的表達(dá)[45]。OsPRI2和OsPRI3是OsPRI1的兩個(gè)同源基因,已被鑒定與OsPRI1功能類(lèi)似,這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也與OsHRZ1直接相互作用,且OsHRZ1促進(jìn)了OsPRI2和OsPRI3的降解[20]。CHIP-qPCR實(shí)驗(yàn)與EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明OsPRI2和OsPRI3也可以與OsIRO2(iron-related transcription factor 2)和OsIRO3的啟動(dòng)子結(jié)合。因此,OsPRI1/2/3相似且具有相同的功能。

    OsIRO3是屬于bHLH IVb亞族的轉(zhuǎn)錄因子,與AtPYE同源,受OsPRI1/2/3正調(diào)控。OsIRO3在根、葉和基節(jié)中表達(dá),營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期葉片中表達(dá)水平較高。OsIRO3基因敲除導(dǎo)致植株對(duì)缺鐵敏感,幼葉嚴(yán)重壞死,根發(fā)育不良,這些證據(jù)表明OsIRO3在響應(yīng)水稻缺鐵上是必不可少的[46]。在缺鐵條件下,iro3在地上部積累了較高水平的鐵,這與上調(diào)OsNAS3的表達(dá)有關(guān),從而導(dǎo)致尼克酰胺NA(nicotianamine)在根中的積累增加。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明,OsIRO3可以直接與OsNAS3啟動(dòng)子中的E-box結(jié)合。此外,在鐵充足的條件下,鐵相關(guān)運(yùn)輸基因的表達(dá)顯著上調(diào)。因此,OsIRO3在響應(yīng)缺鐵的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,并且直接負(fù)向調(diào)節(jié)OsNAS3的表達(dá)[46]。同屬于IVb亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH061,與兩個(gè)已知的鐵調(diào)節(jié)因子有很高的序列相似性:與水稻中的OsIRO3有43%的相似性和擬南芥中的AtPYE有49%的相似性。在缺鐵條件下,OsbHLH061基因敲除導(dǎo)致地上部鐵的過(guò)度積累和對(duì)鐵毒害的敏感,而酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明OsPRI1和OsbHLH061互作[47],表明OsbHLH061是在鐵充足時(shí)與OsPRI1互作共同下調(diào)OsIRO3的表達(dá),負(fù)向控制鐵向地上部的運(yùn)轉(zhuǎn)和在水稻中的積累,維持鐵穩(wěn)態(tài)。

    OsIRO2是屬于bHLH家族Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)水稻中鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因,是OsPRI1的另一個(gè)靶基因。OsIRO2在根和葉中表達(dá),在缺鐵條件下,OsIRO2在營(yíng)養(yǎng)組織中的表達(dá)僅限于根和葉。OsIRO2過(guò)表達(dá)植株地上部的鐵積累量是普通水稻的2-4倍,這表明OsIRO2是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因[48]?;蛐酒治霰砻鳎琌sIRO2在根中調(diào)控59個(gè)缺鐵誘導(dǎo)基因,如OsNAS1、OsNAS2,煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶OsNAAT1(nicotianamine aminotransferase 1),脫氧麥根酸OsDMAS1(rice synthesizes the Fe chelator 2'-deoxymugineic acid 1),OsYSL15和TOM1都受到OsIRO2的正調(diào)控[49]。而OsIRO3直接調(diào)控OsIRO2的表達(dá)。酵母雙雜交試驗(yàn)表明,OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用,已經(jīng)證實(shí)OsPRI1/2/3通過(guò)直接與OsIRO2啟動(dòng)子結(jié)合并激活其啟動(dòng)子來(lái)正向調(diào)節(jié)OsIRO2的表達(dá)[35],而OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用抑制了OsPRI1/2對(duì)OsIRO2的轉(zhuǎn)錄激活。因此,OsIRO3通過(guò)抑制OsIRO2的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)鐵的動(dòng)態(tài)平衡[50]。

    通過(guò)RNA-seq分析鑒定出的OsbHLH156與擬南芥中的FIT同源,是bHLH家族IIIa亞族的轉(zhuǎn)錄因子,主要在根部表達(dá)且受缺鐵誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)證明OsbHLH156具有轉(zhuǎn)錄激活能力。GUS染色結(jié)果顯示OsbHLH156的表達(dá)模式與OsIRO2相似,主要在根成熟區(qū)的上皮、外皮層、皮層、內(nèi)皮層及中柱表達(dá)。OsIRO2定位在細(xì)胞質(zhì),OsbHLH156定位在細(xì)胞核,當(dāng)OsIRO2與OsbHLH156共表達(dá)時(shí),兩蛋白均定位于細(xì)胞核。BIFC和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OsbHLH156與OsIRO2相互作用。在提供三價(jià)鐵條件下,OsbHLH156基因敲除突變體在缺鐵條件下生長(zhǎng)時(shí)葉綠素含量比野生型植株降低了55%,降低了地上部的鐵積累量[51],這一結(jié)果證明在缺鐵條件下OsbHLH156和OsIRO2對(duì)于激活機(jī)制Ⅱ中鐵的吸收及運(yùn)輸是必不可少的,二者共同正向調(diào)控水稻中三價(jià)鐵的吸收與運(yùn)輸。

    雖然水稻和擬南芥采用不同的鐵吸收策略,但是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,無(wú)論是水稻中的OsbHLH156還是擬南芥中的FIT,都通過(guò)與bHLH 家族Ib亞族轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)缺鐵反應(yīng)。OsbHLH156是促進(jìn)OsIRO2核定位所必需的,這一現(xiàn)象最近也被證明在擬南芥中發(fā)生,其中AtbHLH39的核定位需要FIT[52]。這說(shuō)明,這兩種鐵的吸收策略本質(zhì)上并沒(méi)有太大的不同(圖4)。

    圖4 水稻中鐵穩(wěn)態(tài)機(jī)制Fig.4 Fe homeostasis mechanism in rice

    2.3 其他植物鐵穩(wěn)態(tài)bHLH家族

    番茄是機(jī)制I植物,鐵吸收及運(yùn)輸模式與擬南芥相似。FER就是最先從番茄中分離得到的參與高等植物鐵穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子,和擬南芥的FIT同源,在根表皮和外層皮層細(xì)胞層中都有表達(dá)[53]。FER激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LeIRT1的表達(dá),調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)[54]。SlbHLH068是策略I機(jī)制中另一個(gè)bHLH家族的成員,表達(dá)模式與FER的表達(dá)模式具有一定的相似性,在缺鐵條件下表達(dá)量顯著上調(diào),但不受其他營(yíng)養(yǎng)水平的影響。這表明,SlbHLH068在番茄體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)中起特異性作用。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析,SlbHLH066/067/068與擬南芥中AtbHLH38/AtbHLH39/AtbHLH100高度同源,功能也相近。酵母雙雜交和轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SlbHLH068與FER形成異源二聚體激活了酵母細(xì)胞中由LeFRO1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)[55]。這些結(jié)果表明FER/SlbHLH068異二聚體可以直接結(jié)合并激活LeFRO1的表達(dá)以促進(jìn)鐵的吸收。

    木本植物蘋(píng)果也是采取策略I吸收鐵,MdbHLH104被鑒定為蘋(píng)果中應(yīng)對(duì)缺鐵反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,序列與OsPRI1相似。MdbHLH104基因的過(guò)表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株和愈傷組織在缺鐵條件下的H+-ATPase活性和對(duì)鐵缺乏的耐受性[56]。Wang等[47]的研究表明,MdHLH104蛋白直接與MdAHA8基因的啟動(dòng)子結(jié)合正向激活其表達(dá),以及質(zhì)膜H+ATPase活性和鐵的吸收。類(lèi)似地,MdbHLH104直接調(diào)控了3個(gè)鐵敏感的bHLH基因的表達(dá),即MdbHLH38、MdbHLH39和MdPYE。此外,酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MdBHLH104還與MdbHLH105、MdbHLH115、MdPYE、MdbHLH11和MdbHLH121相互作用,共同調(diào)節(jié)MdAHA8基因的表達(dá)、質(zhì)膜H+-ATPase活性和蘋(píng)果愈傷組織中鐵的含量。因此,MdbHLH104是蘋(píng)果中鐵動(dòng)態(tài)平衡的正調(diào)控因子,與其他蘋(píng)果bHLH家族一起通過(guò)調(diào)控MdAHA8基因的表達(dá)和質(zhì)膜H+-ATPase的活性來(lái)調(diào)節(jié)蘋(píng)果對(duì)鐵的吸收。

    從木本植物小金海棠中分離到3個(gè)bHLH基因:MxbHLH01、MxIRO2和MxFIT,并對(duì)其進(jìn)行了鑒定,MxbHLH01的表達(dá)僅限于根,在缺鐵條件下表達(dá)上調(diào),MxbHLH01可能與其他蛋白質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因?qū)θ辫F的響應(yīng)[57]。在缺鐵條件下,MxIRO2在小金海棠的根和葉中均被誘導(dǎo)[58]。它可能與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體或多聚體,以控制與鐵吸收相關(guān)的基因的表達(dá)。目前有關(guān)果樹(shù)應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫的研究較少,還需要進(jìn)一步挖掘果樹(shù)鐵吸收及運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。

    3 總結(jié)與展望

    目前bHLH轉(zhuǎn)錄因子是已知的在高等生物的代謝、生理和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族[59]。從在番茄中分離出并鑒定FER[60]開(kāi)始,人們就從未停止過(guò)對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的探索與研究,尤其是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫的調(diào)控機(jī)制方面。隨著各種生物技術(shù)手段越來(lái)越完善、相關(guān)研究越來(lái)越多,我們對(duì)bHLH家族成員是如何調(diào)控鐵吸收及運(yùn)輸?shù)臋C(jī)理也越發(fā)清晰明了。通過(guò)對(duì)bHLH在植物各組織基因表達(dá)的檢測(cè)、目的基因在細(xì)胞中的定位情況以及其他一些體外蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)的研究,在缺鐵條件下利用兩種機(jī)制調(diào)控鐵平衡的相關(guān)過(guò)程已經(jīng)相對(duì)清晰地展現(xiàn)在了我們的眼前,然而我們現(xiàn)在仍然不知道這個(gè)網(wǎng)絡(luò)最上游的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是如何調(diào)節(jié)的,以及同亞族相似但非冗余的bHLH轉(zhuǎn)錄因子各自具體的功能也還未被研究,這表明我們?nèi)匀粵](méi)有把這個(gè)鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)完全地探索清楚。我們離完全了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)機(jī)理還有很長(zhǎng)一段距離,還需要在探究真相的道路上繼續(xù)前行。

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