基于Wnt/β-catenin 信號通路探究過表達miR-124 對胃癌前病變模型大鼠的干預(yù)效果

羅 文，王偉寧，彭 進，曾 微，姚 思，張嘉怡

長沙市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長沙 410000

胃癌前病變是指在慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍等各種胃病的基礎(chǔ)上，胃黏膜上皮發(fā)生異常增生性改變，該病的臨床癥狀不具有典型性，同時其發(fā)展是一個漫長的癌變過程[1-2]。如果得不到及時診治，將會在多種因素的共同作用下導(dǎo)致胃癌，故診斷為慢性萎縮性胃炎、胃息肉等相關(guān)疾病時，應(yīng)及時就治，進行相關(guān)檢查，根除相關(guān)危險因素，降低癌變的可能性[3]。Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活對胃黏膜組織細胞的裂變、更新及癌變有著重要影響，對其進行抑制可以減輕胃黏膜的破壞，減少炎癥發(fā)生[4]。miR-124 在胃癌前病變中起著重要作用，可作為胃癌前病變的診斷標志物?；谏鲜霰尘?，本文研究分析基于Wnt/β-catenin 信號通路過表達miR-124 對胃癌前病變模型大鼠的干預(yù)效果，以明確miR-124與胃癌前病變大鼠的關(guān)系，為臨床上胃癌前病變的治療或預(yù)防提供有效途徑。

材料與方法

1 研究動物 選取43 只SPF 級Wistar 大鼠作前瞻性研究，體質(zhì)量210 ～ 240g，購置于河南中檢檢測技術(shù)有限公司，動物許可證號：SYXK(豫)2018-0006，所有大鼠在室溫(22oC ～ 25oC)、相對濕度50%的無病原菌籠子中進行喂養(yǎng)，飲用水、食物均經(jīng)高溫高壓殺毒，適應(yīng)性喂養(yǎng)8 d，本實驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關(guān)規(guī)定，且經(jīng)長沙市第一醫(yī)院倫理委員會批準同意。

2 分組與建模 隨機選擇10 只大鼠作為對照組，另外33 只大鼠按照王藝臻等[5]胃癌前病變的建立方法構(gòu)建模型，并灌胃0.02 mol/L MNNG 溶液(5 g/kg)，連續(xù)給予24 周，配合饑飽失常法，進行喂養(yǎng)2 d 飽食、后禁食1 d，期間大鼠自由飲水，并加以情緒刺激，對大鼠胃組織進行確認病理切片檢查，胃黏膜產(chǎn)生損害，杯狀細胞增多，腺體出現(xiàn)減少、萎縮及無規(guī)則排列，胃癌前病變即建模成功。建模過程中死亡3 只大鼠，后將剩余30 只大鼠隨機分為模型組、miR-124 抑制劑組和miR-124 模擬物組，每組10 只。對照組大鼠同期進行蒸餾水喂養(yǎng)。

miR-124 抑制劑組的大鼠腹腔注射miR-124 inhibitor，miR-124 模擬物組的大鼠注射miR-124 mimic，10 μg/d，1 次/d，對照組、模型組大鼠腹腔注射同劑量0.9%氯化鈉注射液，所有大鼠連續(xù)注射8 周。對各組大鼠的表征進行觀察記錄，測量各組大鼠的體質(zhì)量，記錄進食情況。

3 樣本收集 收集每組大鼠右側(cè)頸總動脈血5 mL，離心半徑5 cm、3 000 r/min 離心10 min，分離取其上層清液，保存于-80℃。每組大鼠腹腔注射10%水合氯醛 0.4 mL/100 g 麻醉后處死，在離賁門及幽門0.5 ～ 1.0 cm 處取出全胃，后沿胃大彎將其進行側(cè)切開，用0.9%氯化鈉注射液進行沖洗，取胃黏膜組織，置于液氮內(nèi)冷凍，保存于-80℃冰箱待檢。

4 病理組織學(xué)觀察 取大鼠胃組織，固定于10%甲醛溶液中，48 h 后取出，并對其進行常規(guī)石蠟包埋，制作厚度5 μm 病理切片，進行脫蠟、脫水操作，并采用蘇木素-伊紅染色試劑盒進行染色，中性樹脂將其封片，光學(xué)顯微鏡下觀察其胃黏膜的組織病理變化。使用動物胃鏡對所有大鼠的胃黏膜組織病變情況進行檢查。

5 miR-124 相對表達量檢測 取大鼠胃組織，置于液氮中進行研磨，使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量法對miR-124 表達量進行檢測，通過利用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物序列，啟動PCR 儀，反應(yīng)體系：0.4 μL 上下游引物、1 μL cDNA 模板、10 μL SYBGreen，加蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，72℃ 10 min，共進行40 個循環(huán)，通過2-△△Ct方法計算出miR-124 的表達水平。

6 表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達水平檢測 取出各組大鼠冷凍胃組織0.5 g，對其冰上溶解25 min，后放入漿器中加入1∶9 的0.9%氯化鈉注射液，將其制成組織勻漿，后離心半徑5 cm、3000 r/min 離心10 min，分離取其上層清液，采用ELISA 法檢測EGF 表達水平，試劑盒購自博輝生物科技(廣州)有限公司，貨號：EK-R38399；采用免疫組化法檢測EGFR 表達水平，試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司，貨號：IM-01-1083。

7 白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)水平檢測 取出各組大鼠冷凍血清，對其進行解凍，通過ELISA 法對IL-6、TNF-α 水平進行檢測，采用碳酸鹽緩沖液稀釋待測液，將其倒入每個孔中，置于4℃下過夜，后棄去，沖洗干凈，后向孔中加入1% BSA，37℃溫育1 h，后棄去，沖洗干凈，稀釋抗血清，之后往每孔加入0.1 mL，于37℃下均勻搖晃40 min，后棄去，沖洗干凈，使用TMB進行顯色處理，后在450 nm 波長下檢測OD 值，檢測出IL-6、TNF-α 水平。試劑盒分別購自博輝生物科技(廣州)有限公司、武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：EK-R36902、ER1393。

8 Wnt/β-catenin 通路蛋白表達量 采用Western blot 檢測大鼠胃組織中的Wnt/β-catenin 蛋白相對表達量，取每組大鼠冷凍胃組織，進行冰上溶解25 min，制作組織勻漿，后取0.1 g 勻漿加入檢測試劑提取液，搖晃均勻，以離心半徑5 cm、3000 r/min 離心10 min，提取上層清液，使用BCA 試劑盒檢測Wnt、β-catenin 蛋白含量，提取等量蛋白質(zhì)，100℃變性5 min，通過凝膠電泳進行分離，置于4℃下溫育過夜，反復(fù)沖洗3 次，加入稀釋好的二抗，孵育120 min，反復(fù)沖洗3 次，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH 為內(nèi)參，重復(fù)試驗3 次。

9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析處理。計量資料以±表示，多組間比較采用方差齊性檢驗，兩組間比較采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況 對照組大鼠精神狀態(tài)良好，動作靈敏，體形肥胖，毛色光澤，進食飲水量正常；模擬組大鼠較對照組大鼠精神萎靡不振，體形消瘦，毛色出現(xiàn)枯黃，進食飲水量變少，活動變少且反應(yīng)遲鈍；miR-124 抑制劑組大鼠較對照組、模擬組的大鼠精神更加不濟，體形嚴重消瘦，毛色枯黃嚴重，進食飲水量較少，活動緩慢；miR-124 模擬物組大鼠較模擬組、miR-124 抑制劑組大鼠精神尚好，體形增加，毛色有光澤，進食飲水量較多，動作相對靈活。

2 大鼠胃病理組織學(xué)觀察 如圖1 所示，對照組大鼠，胃組織結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯變化，胃黏膜表面平整，排列規(guī)則有序；模型組大鼠，胃黏膜萎縮，腺體變少，杯狀細胞出現(xiàn)，排列無序；miR-124 抑制劑組大鼠胃黏膜萎縮更加嚴重，腺體變更少，杯狀細胞出現(xiàn)更多；miR-124 模擬物組大鼠腺體變多、杯狀細胞減少。

圖1 各組大鼠胃病理組織學(xué)觀察(HE 染色，200×)A：對照組；B：模型組；C：miR-124 抑制劑組；D：miR-124 模擬物組Fig.1 Pathological histological observation of rats' stomach tissues (HE staining, 200×)A: control group; B: model group; C: miR-124 inhibitor group; D: miR-124 simulator group

3 大鼠胃組織miR-124 相對表達量對比 如表1所示，與對照組相比，模型組、miR-124 抑制劑組、miR-124 模擬物組miR-124 相對表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，miR-124 抑制劑組miR-124 表達水平下降，miR-124 模擬物組miR-124 相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與miR-124 抑制劑組相比，miR-124 模擬物組miR-124 相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腎組織miR-124 相對表達量對比Tab. 1 Comparison of miR-124 expression in kidney tissues

4 各組大鼠EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平對比如表2 所示，與對照組相比，模型組、miR-124抑制劑組、miR-124 模擬物組EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，miR-124 抑制劑組EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 升高，miR-124 模擬物組EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與miR-124 抑制劑組相比，miR-124 模擬物組EGF、EGFR、IL-6、TNF-α 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血清標志物水平對比Tab. 2 Comparison of serum biomarkers levels in each group

5 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達量對比如表3 所示，與對照組相比，模型組、miR-124 抑制劑組、miR-124 模擬物組胃組織Wnt/βcatenin 表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，miR-155 抑制劑組Wnt、β-catenin表達量升高，miR-124 模擬物組Wnt/β-catenin 表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與miR-124 抑制劑組相比，miR-124 模擬物組Wnt/βcatenin 表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

表3 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達量對比Tab. 3 Comparison of wnt / β -catenin pathway protein expression in rats

圖2 Wnt/β-catenin 信號通路蛋白Western blot 圖Fig.2 Western blot of Wnt/β -catenin signaling pathway protein

討 論

胃癌作為全球癌癥發(fā)病率極高的惡性腫瘤，具有較高的病死率，對人類的生命安全帶來了嚴重威脅，目前對該病的發(fā)病原因尚無明確定論，對疾病的預(yù)防較困難，故對其病變前的探究對該病的預(yù)防具有重要意義[6-7]。胃癌前病變是胃黏膜病變的過程，主要包括腸上皮化生和異型增生，是正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的一個重要階段。

miRNA 作為一種單鏈的小分子，具有時序性、保守性及組織特異性，在核細胞內(nèi)活躍，可參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8-9]。miR-124 在miRNA 中屬于高度保守的小分子，其表達異?？梢l(fā)靶基因miRNA 無效，促使腫瘤發(fā)生。miR-124 可通過下調(diào)ROCK1 表達，達到抑制胃癌細胞的遷移，同時參與對腫瘤EMT 的調(diào)控。EGF 作為一種肽類物質(zhì)，對胃黏膜具有修復(fù)作用，EGFR 是活躍在間質(zhì)、上皮、神經(jīng)源性組織中的蛋白受體，兩者結(jié)合會對胃酸分泌產(chǎn)生抑制作用，保護胃黏膜[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGF、EGFR高表達于胃癌前病變大鼠，上調(diào)大鼠miR-124 表達，可降低EGF、EGFR 表達水平，增加大鼠體質(zhì)量和進食飲水量，使糞便恢復(fù)正常，并改善大鼠的胃黏膜組織。相關(guān)研究顯示，miR-124 可降低胃癌細胞的非停泊依賴性生長能力，將miR-124 mimics 轉(zhuǎn)染MKN-45 細胞，可使細胞克隆小且數(shù)量也減少，從而抑制胃癌細胞的分化，且參與細胞增殖的分子調(diào)控，下調(diào)miR-124 表達，會促進細胞增殖，加速胃癌前病變的發(fā)生發(fā)展，與本文研究一致[13-15]。這表明過表達miR-124 可減少對胃黏膜的損害，提高腸胃功能，改善臨床表征。

TNF-α 作為具有細胞毒性的促炎性細胞因子，參與機體內(nèi)的免疫應(yīng)答；IL-6 對細胞的分化和生長具有重要的調(diào)節(jié)作用，其水平失調(diào)可造成疾病的發(fā)生，對機體免疫應(yīng)答、造血功能起著重要作用[16-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌前病變大鼠中IL-6、TNF-α 高表達，過表達miR-124 可降低大鼠體內(nèi)IL-6、TNF-α 表達水平。相關(guān)研究表明，miR-124 可對產(chǎn)生趨化因子的能力進行調(diào)節(jié)，過表達miR-124 可降低巨噬細胞及其他促炎性細胞因子活性，抑制胃癌前病變的發(fā)展，與本文研究一致[20-22]。這表明過表達miR-124 能夠有效改善大鼠的炎癥反應(yīng)。

Wnt 信號通路是一種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，在生物進化和癌癥中具有重要作用，能幫助人們理解疾病的發(fā)生發(fā)展機制，給疾病治療提供靶點[23]。Wnt/β-catenin 信號通路參與了細胞的黏附作用，可激活原癌基因，使其細胞增殖分化，如果這條通路的蛋白發(fā)生了變化，就會導(dǎo)致信號出現(xiàn)異?；罨?，可誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生[24]。Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活可促使胃黏膜上皮細胞及固有細胞的增殖分化，從而產(chǎn)生病變。通過對Wnt/βcatenin 信號通路進行抑制，可抑制其胃黏膜細胞的增殖，加快細胞的死亡，改善胃黏膜損害[25]。本文研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-124 可對Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生抑制作用，改善大鼠的胃黏膜損害。

綜上所述，過表達miR-124 可抑制胃癌前病變模型大鼠體內(nèi)的細胞增殖，使胃黏膜損傷得到改善，減少其炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與大鼠的Wnt/β-catenin 信號通路被抑制相關(guān)。雖然本研究中過表達miR-124 可使胃癌前病變得到改善，其作用機制可能與Wnt/β-catenin 通路相關(guān)，但僅為本研究結(jié)果，臨床并無研究分析其關(guān)系，因此本文上述結(jié)果還需后續(xù)研究進一步驗證，為胃癌前病變的研究提供一定參考價值。

作者貢獻羅文：總體構(gòu)思，資金獲取，資源提供，撰寫初稿；王偉寧：總體構(gòu)思，資金獲取，監(jiān)督指導(dǎo)，審讀及修訂；彭進：方法設(shè)計，項目管理，資源提供，技術(shù)支持；曾微：規(guī)范分析，軟件處理，可視化處理；姚思、張嘉怡：數(shù)據(jù)管理，調(diào)查研究，有效驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：luow198@126.com。