應(yīng)用16S rDNA 擴增子序列分析去卵巢骨丟失小鼠口腔菌群的變化

陳浩彬，羅世城，曹 祚，張攻孜，張書威，隋 熠，盛 晨，石 斌，羅 楊，張立海,3

1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部，北京 100048

絕經(jīng)后期指女性進入絕經(jīng)后的生命時期，這一時期女性卵巢功能衰退，體內(nèi)的雌激素水平顯著下降[1]，同時患系統(tǒng)性疾病的風(fēng)險升高[2]。近年來，越來越多的研究表明女性進入絕經(jīng)后期罹患口腔黏膜病和加速牙周骨質(zhì)丟失的風(fēng)險更高，絕經(jīng)后女性雌激素水平的下降會導(dǎo)致牙槽骨吸收加速，從而加重牙周炎等口腔疾病的進程[3]?？谇痪旱奈蓙y被認為在口腔疾病和多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)病和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，如糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和心血管疾病[4]。雖然絕經(jīng)后婦女發(fā)生口腔致病菌感染和患牙周疾病的風(fēng)險升高[5]，但絕經(jīng)后期否會直接對口腔菌群的變化產(chǎn)生作用尚不清楚。本研究以卵巢切除誘導(dǎo)的骨丟失小鼠為模型，初步分析小鼠卵巢切除后口腔菌群的變化，為研究絕經(jīng)后婦女口腔疾病的加重提供新的思路。

材料與方法

1 實驗動物 9 周齡的雌性C57BL/6J 小鼠16只，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SPF級條件下飼養(yǎng)，室溫(22 ± 2)℃，相對濕度40% ～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進行實驗。本實驗經(jīng)解放軍總醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過，倫理審批編號：2019-X15-44。

2 主要材料、試劑與儀器 戊巴比妥鈉(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)；3-0 手術(shù)縫合線[強生(中國)醫(yī)療器材有限公司]；植絨口腔采樣拭子(COPAN，意大利)，eSwab 運送培養(yǎng)基保存液(COPAN，意大利)；多聚甲醛(百奧康生物技術(shù)有限公司)；Inveon MM CT(西門子，德國)，Inveon Acquisition Workplace 掃描軟件(西門子，德國)，Inveon Research Workplace 分析軟件(西門子，德國)；COBRA_Exxim 重建軟件；illumina NovaSeq 測序平臺(北京諾禾致源科技股份有限公司)。

3 動物分組與模型建立 16 只小鼠隨機分為卵巢切除(ovariectomy，OVX)組和假手術(shù)(shamoperated，Sham)組，每組8 只。各組小鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉劑量為50 mg/kg。OVX 組小鼠放置于俯臥位，碘伏消毒手術(shù)部位，沿小鼠背部中線胸腰段處皮膚做一處約1 cm 縱形切口，并切開兩側(cè)肋脊角處肌層進入腹腔，找到并結(jié)扎兩側(cè)輸卵管，切除卵巢。用3-0 縫合線縫合肌層和皮膚并用碘伏消毒。Sham組小鼠進行同樣的消毒并切開皮膚和肌層進入腹腔，找到卵巢后切除周圍與卵巢大小相似的脂肪組織，不結(jié)扎輸卵管和切除卵巢，縫合肌層和皮膚后消毒。兩組小鼠在術(shù)后腹腔注射抗生素，并在SPF 級條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4 周。

4 動物及樣本處理 造模4 周后，于清晨時用無菌的口腔采樣拭子刷取小鼠口腔內(nèi)壁和牙周，并保存于eSwab 保存液中，4℃轉(zhuǎn)運?？谇粯颖静杉^程中注意無菌操作，避免取樣時環(huán)境中微生物的污染。過量戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死小鼠，取出完整股骨并保存于4%多聚甲醛固定液中，固定7 d。

5 顯微CT 掃描及圖像處理 對Inveon MM CT進行校準(zhǔn)并掃描股骨樣本，掃描參數(shù)：電壓強度60 kV，電流強度220 μA，曝光時間1 500 ms，有效像素值8.89 μm。二維圖像重建為三維圖像并進行分析。興趣區(qū)域(region of interest，ROI)為股骨遠端生長板下0.5 ～ 1 mm 處骨松質(zhì)。分析骨結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨表面積/骨體積(bone surface area/bone volume，BS/BV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)和骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

6 16S rDNA 高通量測序 口腔菌群樣本取樣后，采用CTAB 法對樣本的DNA 進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量樣本DNA 用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的DNA為模板進行PCR，擴增區(qū)域為16S V3 ～ V4。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對目的條帶進行回收。使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和qPCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進行上機測序。

7 測序數(shù)據(jù)分析 從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，使用FLASH 軟件對樣本的Reads 進行拼接，使用Fastp 軟件進行高質(zhì)量過濾，使用Usearch 軟件檢測去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用QIIME2 軟件的DADA2 模塊降噪，并過濾掉豐度小于5 的序列，獲得擴增子序列變異(amplicon sequence variants，ASVs)與特征表，將得到的ASVs與數(shù)據(jù)庫比對，從而得到每個ASV 的物種信息；計算Chao1 和Simpson 指數(shù)并對Alpha 多樣性的組間差異進行分析；計算Unifrac 距離，并使用R 軟件來繪制PCA 降維圖；使用R 軟件進行t檢驗，對兩個比較組在門、綱、目、科和屬5 個分類水平上進行差異性檢驗并獲得P值，篩選出P值小于0.05 的物種即為組間顯著差異性物種；通過LEfSe 軟件完成組間顯著差異性物種分析，設(shè)置LDA score 閾值為4。

8 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的計量數(shù)據(jù)以±表示，計量資料符合方差齊性時采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，計量資料不符合方差齊性時采用Wilcoxon 秩和檢驗進行兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 股骨樣本顯微CT 結(jié)果 卵巢切除術(shù)后4 周時，OVX 組小鼠的骨密度相較Sham 組顯著下降(P=0.009 6)(圖1A)；同時OVX 組骨體積分數(shù)(P=0.017 9)、骨小梁厚度(P=0.046 9)和骨小梁數(shù)量(P=0.033 8)下降，骨表面積/骨體積(P=0.043 2)和骨小梁分離度顯著升高(P=0.038 4)(圖1B ～ 圖1F)；顯微CT 圖像可見OVX 組股骨骨松質(zhì)量減少，小梁結(jié)構(gòu)破壞(圖1G)。說明卵巢切除的小鼠出現(xiàn)了骨丟失現(xiàn)象，模型建立成功。

圖1 卵巢切除后小鼠股骨的顯微CT 結(jié)果A：骨密度(BMD)；B：骨體積分數(shù)(BV/TV)；C：骨表面積/骨體積(BS/BV)；D：骨小梁厚度(Tb.Th)；E：骨小梁數(shù)量(Tb.N)；F：骨小梁分離度(Tb.Sp)；G：股骨顯微CT 掃描圖像Fig.1 MicroCT results of the femur of mice after ovariectomyA: Bone mineral density (BMD); B: Bone volume/total volume (BV/TV); C: Bone surface area/bone volume (BS/BV); D: Trabecular thickness (Tb.Th); E: Trabecular number (Tb.N); F: Trabecular Spacing (Tb.Sp); G: MicroCT scan of femur

2 口腔樣本的ASVs 分析 將OVX 組和Sham組樣本的共有與特有的ASVs 繪制為韋恩圖。ASVs結(jié)果分析，兩組的口腔菌群共同含有687 種ASVs，Sham 組特有1 086 種，OVX 特有930 種(圖2)。

圖2 口腔菌群的ASVs 分析韋恩圖Fig.2 Venn diagram of ASVs analysis of oral microbiota

3 物種相對豐度分析 根據(jù)ASVs 注釋結(jié)果和各樣品特征表，獲得門和屬水平的物種豐度表，選取最大豐度排名前10 的物種繪制物種相對豐度的柱形圖(圖3)。門水平上兩組口腔樣本相對豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria)，其次有厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)和擬桿菌門(Bacteroidota)等(圖4A)。屬水平上兩組口腔樣本相對豐度最高的是Ralstonia 菌屬，其次是假單胞菌屬(Pseudomonas)(圖4B)。

圖3 口腔菌群各組門水平和屬水平物種相對豐度柱形圖A：門水平相對豐度；B：屬水平相對豐度Fig.3 Relative abundance bar chart of species at phylum level and genus level for each group of oral microbiotaA: Relative abundance at phylum level; B: Relative abundance at genus level

圖4 各組樣本菌群豐度和菌群多樣性差異A: Chao1 指數(shù)差異箱型圖；B: Simpson 指數(shù)差異箱型圖Fig.4 The differences of microbiota abundance and microbiota diversity between each groupA: Box diagram of Chao1 index difference; B: Box diagram of Simpson index difference

4 α 多樣性指數(shù)差異分析 對菌群兩組間Chao1和Simpson 指數(shù)進行分析，比較OVX 組與Sham組之間菌群豐度和菌群多樣性差異。結(jié)果顯示，口腔菌群中OVX 組與Sham 組的Chao1 指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(圖5A)；而OVX 組的Simpson 指數(shù)顯著低于Sham 組(圖5B)。

圖5 口腔各組樣本的PCA 分析圖Fig.5 Principal components analysis (PCA) of oral species between each group

5 主成分分析 主成分分析(principal components analysis，PCA)是一種基于ASV 相對豐度分布對多維數(shù)據(jù)進行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法?；贏SV 水平的PCA 分析結(jié)果顯示，OVX 組和Sham 組的組內(nèi)樣本距離較小，表明組內(nèi)樣本的物種結(jié)構(gòu)構(gòu)成相似，OVX 組和Sham 組的組間彼此分開，說明兩組的樣本間的物種結(jié)構(gòu)存在差異。

6 物種差異分析 通過t檢驗方法分析菌群在門、綱、目、科和屬水平下組間有顯著差異性的物種，結(jié)果顯示，在門水平上，相較于Sham組，OVX 組的擬桿菌門(P=0.010 6)和梭桿菌門(Fusobacteriota)(P=0.006 9)豐度下降(圖6A)；綱水平上，OVX 組梭桿菌綱(Fusobacteriia)豐度下降(P=0.006 9)，Negativicutes 綱豐度上升(P=0.004 5)(圖6B)；目水平上OVX 組噬纖維菌目(Cytophagales)(P=0.015 5)、放線菌目(Actinomycetales)(P=0.041 6)上升，梭桿菌目(Fusobacteriales)(P=0.006 9)、Peptococcales 菌目(P=0.036 5)下降(圖6C)；科水平上拜葉林克氏菌科(Beijerinckiaceae)(P=0.016 3)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)(P=0.038 8)、放線菌科(Actinomycetaceae)(P=0.041 6)上升， 梭桿菌科(Fusobacteriaceae)(P=0.006 9)、消化球菌科(Peptococcaceae)(P=0.036 5)、顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)(P=0.041 4)下降(圖6D)；屬水平上，口腔樣本OVX 組的梭桿菌屬(Fusobacterium)(P=0.006 9)、普雷沃氏菌UCG-001 屬(P=0.015 7)、福涅拉氏菌屬(Fournierella)(P=0.020 1)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(P=0.025 5)、乳酸乳球菌屬(Lactococcus)(P=0.027 6)、薩特氏菌屬(Sutterella)(P=0.033 3)等菌屬的豐度相比Sham 組降低；Lachnoclostridium 菌屬(P=0.017 9)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)(P=0.032 8)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(P=0.037 4)、放線菌屬(Actinomyces)(P=0.040 4)、Atopostipes 菌屬(P=0.048 3)等菌屬的豐度相比Sham 組升高(圖6E)。LEfSe 分析結(jié)果顯示，LDA score 大于4 時，厚壁菌門和芽孢桿菌綱(Bacilli)的相對豐度在Sham 組升高(圖7)。

圖6 口腔各組物種相對豐度差異分析A：門水平物種相對豐度差異；B：綱水平物種相對豐度差異；C：目水平物種相對豐度差異；D：科水平物種相對豐度差異；E：屬水平物種相對豐度差異Fig.6 Differences in relative abundance of oral species among different groupsA: Differences in relative abundance at phylum level; B: Differences in relative abundance of species at class level; C: Differences in relative abundance of species at order level; D: Differences in relative abundance of species at family level; E: Differences in relative abundance of species at genus level species

圖7 口腔各組樣本的LEfSe 分析Fig.7 LEfSe analysis of oral species between each group

討 論

人體的皮膚和黏膜定植著大量的微生物，以細菌為主，主要定植的器官是口腔和胃腸道。長久的進化過程中機體與微生物之間形成了一種互利共生的關(guān)系，而微生物失調(diào)會擾亂這種關(guān)系，并可能誘發(fā)或加重疾病[6-7]?？谇皇侨梭w第二大微生物聚集器官，僅次于腸道。解剖學(xué)上口腔和腸道相連，并同屬于消化系統(tǒng)?？谇坏拿庖吖δ芪蓙y和微生物菌群變化與多種系統(tǒng)性代謝疾病相關(guān)，如糖尿病、骨質(zhì)疏松、阿爾茨海默病等[8-9]，口腔菌群也被認為是系統(tǒng)性疾病新的潛在治療靶點[10]。但口腔微生物群是否參與了絕經(jīng)后期口腔疾病的發(fā)生發(fā)展仍缺乏足夠的證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后未進行激素替代治療患者更易罹患牙周疾病[11]。對口腔致病菌定植的研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性患者不僅牙周炎患病率更高，口腔樣本中也檢出致病菌具核梭桿菌、牙卟啉單胞菌和伴放線桿菌[12]。致病菌在絕經(jīng)后伴牙周疾病患者的口腔中被發(fā)現(xiàn)，但絕經(jīng)后期卵巢功能衰退本身是否會直接影響口腔菌群的變化尚不明確。

卵巢切除術(shù)是建立小鼠絕經(jīng)模型的常用方法，通過小鼠雌激素缺乏模擬絕經(jīng)狀態(tài)[13]，本研究通過卵巢切除術(shù)建立小鼠絕經(jīng)模型，并用顯微CT 掃描分析驗證了卵巢切除后4 周時，小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了骨丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，這與目前相關(guān)的研究結(jié)論一致[14]，并證實了我們小鼠絕經(jīng)模型的成功建立。通過高通量序列分析口腔菌群變化，發(fā)現(xiàn)OVX 組和Sham 組的菌群出現(xiàn)了各組特有的1 000 個左右的ASVs 序列，這說明在卵巢去勢后，小鼠的口腔的物種可能發(fā)生了變化。α 多樣性指數(shù)分析結(jié)果可信。Chao1 和Simpson指數(shù)分別是α 多樣性指數(shù)差異分析中描述菌群豐度和菌群多樣性的指數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)OVX 組菌群的Chao1 指數(shù)未產(chǎn)生顯著改變，而Simpson 指數(shù)顯著下降。說明卵巢去勢后4 周時，小鼠口腔菌群豐度沒有產(chǎn)生顯著的差異，但菌群的多樣性下降了，這也證實了去勢后小鼠的口腔菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，然而菌群α 多樣性與機體的健康的關(guān)系仍然存在爭議，有研究認為齲齒等口腔疾病患者的牙菌斑菌群的α 多樣性顯著低于健康人群[15]，而也有研究認為老年齲齒患者的口腔菌群α 多樣性并未產(chǎn)生差異性的改變[16]，而吸煙等因素則能使口腔菌群的α 多樣性升高[17]。

物種差異分析的結(jié)果顯示，卵巢去勢后小鼠口腔菌群從門水平到屬水平上都出現(xiàn)多個差異物種，其中部分水平上的差異物種在相關(guān)疾病的研究中被提及。門水平上，口腔擬桿菌門和梭桿菌門被認為與牙周炎和阿爾茨海默病等疾病存在相關(guān)性，相比健康人群，阿爾茨海默病伴中重度牙周炎患者被發(fā)現(xiàn)口腔擬桿菌門豐度降低，而梭桿菌門豐度增高[18]，但也有研究認為擬桿菌門同多種其他革蘭陰性菌一致，是牙周炎患者口腔的優(yōu)勢菌門之一[19]；綱水平上，Negativicutes 綱被發(fā)現(xiàn)與兒童齲齒的發(fā)病存在相關(guān)性[20]；屬水平上，有研究認為口腔乳酸乳球菌屬可以抑制口腔病原體的作用，抑制種植體周圍炎和骨丟失[21-22]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)口腔乳酸乳球菌屬的豐度在OVX 組中產(chǎn)生了下降，這可能與絕經(jīng)患者更易罹患牙周疾病相關(guān)；放線菌屬被認為與齲病的發(fā)生呈正相關(guān)[23]。雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死(bisphosphonaterelated osteonecrosis of the jaws，BRONJ)是雙膦酸鹽類藥物治療骨質(zhì)疏松癥中可能出現(xiàn)的并發(fā)癥[24]，BRONJ 也被認為與雙膦酸鹽治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松時口腔放線菌聚集相關(guān)[25]，我們的結(jié)果可能說明了放線菌屬在進入絕經(jīng)后期的過程中在口腔就產(chǎn)生了聚集。物種差異分析結(jié)果證明在多個物種水平上，卵巢去勢后小鼠的口腔菌的物種豐度產(chǎn)生了差異性的改變。但這些物種相對豐度的改變與口腔疾病的潛在關(guān)系仍需進一步探究。

雌激素水平下降導(dǎo)致的骨丟失被認為是加重絕經(jīng)后期婦女牙周疾病的主要原因；近年來，牙周炎、牙槽骨丟失以及牙齒缺失也被證實與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病密切相關(guān)[26]。而骨丟失是否參與了絕經(jīng)后期對口腔菌群多樣性和結(jié)構(gòu)的影響仍需更多的證據(jù)支撐。本實驗初步發(fā)，現(xiàn)卵巢切除術(shù)后小鼠口腔菌群的多樣性、菌群結(jié)構(gòu)和物種構(gòu)成均發(fā)生了變化。但在口腔菌群結(jié)構(gòu)變化與機體骨代謝水平的聯(lián)系以及絕經(jīng)患者口腔菌群結(jié)構(gòu)改變與口腔疾病惡化的因果關(guān)系等研究方面仍存在局限性。需要進一步實驗探究和驗證。

作者貢獻陳浩彬、羅世城、盛晨：實驗操作，論文撰寫；張攻孜、張書威、曹祚：數(shù)據(jù)收集；隋熠：數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計學(xué)分析；石斌、羅楊：技術(shù)支持；張立海：研究指導(dǎo)，論文修改，經(jīng)費支持。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：1442859440@qq.com。