miRNA-30a-5p過表達對腎癌細胞株786-0增殖、凋亡的影響

來衛(wèi)東,戴尊收,趙愛國,胡娜,劉琳琳,顧潤國

(1山東醫(yī)學高等?？茖W校，山東臨沂 276000；2山東醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院)

miRNA-30a-5p過表達對腎癌細胞株786-0增殖、凋亡的影響

來衛(wèi)東1,戴尊收2,趙愛國1,胡娜1,劉琳琳1,顧潤國1

(1山東醫(yī)學高等?？茖W校，山東臨沂 276000；2山東醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院)

目的觀察miRNA-30a-5p過表達對腎癌細胞株786-0增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法將腎癌細胞株786-0分為模擬物組、抑制物組、未轉染組，模擬物組轉染miRNA-30a-5p模擬物，抑制物組轉染miRNA-30a-5p抑制物，未轉染組為正常腎癌細胞株786-0。采用實時熒光定量PCR法檢測模擬物組、抑制物組、未轉染組腎癌細胞株786-0及正常人腎小管上皮細胞HK-2(正常組)miRNA-30a-5p，CCK-8法觀察各組培養(yǎng)24、48、72 h后的細胞增殖能力，流式細胞術觀察前三組細胞凋亡情況，Western blotting法檢測前三組細胞中異黏蛋白(MTDH)表達。結果正常組、模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞miRNA-30a-5p mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常組、模擬物組、抑制物組與未轉染組相比，P均<0.01。正常組在培養(yǎng)24、48、72 h后的吸光度值分別為0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模擬物組分別為0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物組分別為0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未轉染組分別為0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常組、模擬物組各時點分別與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞凋亡率分別為11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模擬物組與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。模擬物組、抑制物組、未轉染組MTDH蛋白的相對表達量分別為1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模擬物組與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。結論miRNA-30a-5p過表達可明顯抑制腎癌細胞株786-0的增殖、促進細胞凋亡，其可能是通過調控MTDH蛋白表達實現(xiàn)的。

腎細胞癌；微小RNA-30a-5p；細胞增殖；細胞凋亡；異黏蛋白

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在過去20年里其發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢。隨著對腎癌發(fā)生、發(fā)展過程中分子機制的深入研究，尋找調控腎癌細胞增殖分化的相關基因，已成為腎癌分子生物學研究領域的熱點。微小RNA(miRNA)自1993年被首次發(fā)現(xiàn)以來，大量研究證實miRNA參與了細胞的增殖、分化、凋亡。miRNA-30a系miRNA-30家族成員，編碼基因定位于人類染色體6ql3,與很多惡性腫瘤相關[1]。已有研究指出miRNA-30a-5p是調控肝癌、肺癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。目前，miRNA-30a-5p在腎癌細胞中的作用未見研究報道。生物信息學預測研究顯示異黏蛋白(MTDH)是miRNA-30a-5p可能作用的靶基因[2]。2014年7月～2016年7月，我們觀察了miRNA-30a-5p過表達對腎癌細胞株786-0增殖凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 腎癌細胞株786-0及正常人腎小管上皮細胞HK-2購自中國科學院上海細胞庫；脂質體(LipofectamineTM2000)轉染試劑購自美國Invitrogen公司；miRNA-30a-5p模擬物、抑制物、特異性莖環(huán)逆轉錄引物及PCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8)購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒均購自北京TIANGEN生化科技有限公司。兔抗MTDH多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 分別將腎癌細胞株786-0及人腎小管上皮細胞HK-2接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換培養(yǎng)液1次，視細胞生長情況用0.25%的胰酶消化每周傳代1～2次，當細胞穩(wěn)定呈對數(shù)生長期時開始用于實驗。

1.2.2 細胞轉染 將腎癌細胞株786-0分為模擬物組、抑制物組、未轉染組，模擬物組轉染miRNA-30a-5p模擬物，抑制物組轉染miRNA-30a-5p抑制物，未轉染組為正常腎癌細胞株786-0。轉染前24 h于6孔板中接種模擬物組、抑制物組對數(shù)生長期細胞，細胞密度為2×105/mL。按照脂質體轉染試劑的說明書進行轉染miRNA-30a-5p模擬物或抑制物。每組設3個復孔，轉染后用轉染試劑于37 ℃在培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，每孔中加入含有20%胎牛血清無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至24 h，更換為新鮮含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞進行實驗。

1.2.3 各組細胞miRNA-30a-5p mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集轉染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞，同時收集呈對數(shù)生長期的正常人腎小管上皮細胞HK-2(正常組)，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度，反轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測各組細胞miRNA-30a-5p mRNA的表達。每個樣本重復3次。反應體系：SYBR Green Supermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA樣品1 μL,dH2O 8 μL，共計20 μL。反應條件：預變性95 ℃ 15 s，1個循環(huán)；PCR反應，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，1個循環(huán)。擴增miRNA-30a-5p的同時，擴增管家基因U6。miRNA-30a-5p特異性莖環(huán)逆轉錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGFFTTGAGCTTCCAGT-3′；上游序列:5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3′，下游序列：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；內參U6引物，上游序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。將正常組設為對照，標準化為1，采用2-ΔΔCt法分析各組miRNA-30a-5p mRNA的相對表達量。

1.2.4 各組細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。制備上述4組單細胞懸液，將1×103～1×104/mL細胞接種于96孔板，每孔體積100 μL，每組設3個復孔。37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞貼壁后，模擬物組、抑制物組轉染miRNA-30a-5p模擬物和抑制物。將轉染后6 h換液時間作為CCK-8實驗的0 h，分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4～6 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm波長各孔吸光度值，記錄結果。

1.2.5 各組細胞凋亡情況觀察 將6孔板中轉染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞用胰酶消化后，收集細胞懸液于室溫下離心5 min。棄上清液后收集細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次。離心，收集細胞，用250 μL稀釋的混合緩沖液重新懸浮細胞，調整細胞密度不少于1×105/mL。取100 μL細胞懸液，加入5 μL的Annexin V-FITC與1 μL的碘化丙錠染色，混勻后室溫下避光孵育15 min。加400 μL的1×PBS緩沖液于流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。實驗重復3次,取平均值。

1.2.6 各組細胞MTDH蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集轉染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞，提取細胞總蛋白，檢測樣品蛋白含量。分別取樣品蛋白20 μg加上樣緩沖液至終體積15 μL，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到硝酸纖維素濾膜上。取出硝酸纖維素濾膜，置于5%脫脂奶粉(用PBS配制)室溫2 h封膜。加入MTDH一抗(1 μL一抗加入0.02 mmol/L PBST 2 mL)4 ℃孵育過夜，0.02 mmol/L PBST洗膜3次。加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3次。DAB顯色。凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

2 結果

2.1 各組細胞miRNA-30a-5p mRNA表達比較 正常組、模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞miRNA-30a-5p mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常組、模擬物組、抑制物組與未轉染組相比，P均<0.01。

2.2 各組細胞增殖活性比較 正常組在培養(yǎng)24、48、72 h后的吸光度值分別為0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模擬物組分別為0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物組分別為0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未轉染組分別為0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常組、模擬物組各時點分別與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。

2.3 各組細胞凋亡率比較 模擬物組、抑制物組、未轉染組細胞凋亡率分別為11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模擬物組與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。

2.4 各組細胞MTDH蛋白表達比較 模擬物組、抑制物組、未轉染組MTDH蛋白的相對表達量分別為1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模擬物組與抑制物組、未轉染組相比，P均<0.01。

3 討論

腎癌占成人惡性腫瘤的2%～7%，早期腎癌主要采取手術治療，但手術方式的進步并未顯著提高腎癌患者的生存率。由于腎癌細胞的生物學行為復雜多變，且具有放化療抵抗特點，近30%的手術患者術后3年內腫瘤復發(fā)，總體5年生存率不到10%[3]。因此，研究調控腎癌細胞增殖分化的相關基因，通過靶向抑制，對提高腎癌患者的生存率，具有重要意義。

miRNA作為新興的生物標志物，有望成為腎癌診斷治療及判斷預后的重要靶點。miRNA在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，既可以表達上調發(fā)揮致癌基因的作用，也可以表達下調發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。并且，腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性亦受miRNA的影響[5]。目前，miRNA在腎腫瘤中的研究還處在初級階段。Chow等[6]發(fā)現(xiàn)，33種miRNA在腎透明細胞癌組織中發(fā)生改變，其中21種呈高表達的miRNA在腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。腎細胞癌體內體外實驗顯示，miRNA-137通過抑制磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B信通路抑制腎癌細胞生長[7]。此外，多項研究[8～10]顯示miRNA-141-3p、miRNA-145-5p、miRNA-218及miRNA-27a等均在腎癌中起抑癌基因作用。但另有研究[11]發(fā)現(xiàn)miR-630在腎癌細胞中扮演著促癌基因的角色。

miRNA-30家族的成員包括miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d、miRNA-30e等，miRNA-30a產生于內含子翻譯單位，有miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p兩種形式[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30a/miRNA-30a-5p可在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、白血病等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[12～15]，然而miRNA-30a-5p在腎癌細胞中的作用未見研究報道。本研究結果發(fā)現(xiàn)，未轉染組較正常組miRNA-30a-5p表達下調，且與抑制物組、未轉染組比較，模擬物組細胞增殖能力明顯下降，細胞凋亡明顯增加。上述實驗結果提示miRNA-30a-5p的高表達可抑制腎癌786-0細胞增殖，促進細胞凋亡，miRNA-30a-5p在腎癌的發(fā)展中起抑癌基因的作用。

MTDH在多種腫瘤(如肝癌、卵巢癌、子宮內膜癌等[16～18])中呈高表達，增加腫瘤細胞的侵襲性，并介導多種形式的化療抵抗。Li等[2]通過熒光素酶活性分析實驗證實MTDH是miRNA-30a-5p的直接靶向基因，在肝癌組織中，miRNA-30a-5p的表達與MTDH的表達具有明顯的負相關。亦有實驗表明，miRNA-30a可通過MTDH實現(xiàn)對乳腺癌腫瘤細胞的抑制作用[19]。秦丹丹等[20]研究認為，MTDH與miRNA-30a結合位點具有物種保守性。在腎癌細胞中轉染miRNA-30a類似物后，MTDH表達被抑制，MTDH與miRNA-30a具有靶向關系。此外，通過上調miR-30d的表達可靶向Akt/FOXO抑制MTDH的表達，從而抑制腎癌細胞的增殖，促進其凋亡[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，模擬物組MTDH蛋白的相對表達量較未轉染組及抑制組明顯下降，提示miRNA-30a-5p可能通過靶向MTDH而抑制腎癌細胞株786-0的增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，miRNA-30a-5p在腎癌細胞中起抑癌基因的作用，其可能是通過調控MTDH蛋白表達實現(xiàn)的。但是，同一miRNA可以調控多個靶基因，不同的miRNA分子也可協(xié)同調控同一靶基因。miRNA與它們的靶基因組成了一個復雜的調控系統(tǒng)。因此，還應該進一步研究腎癌細胞中異常表達的miRNA之間的相互聯(lián)系，為腎癌的早期診斷治療提供新的分子生物學靶點。

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EffectsofoverexpressionofmiRNA-30a-5ponproliferationandapoptosisofrenalcarcinomacellline786-0

LAIWeidong1,DAIZunshou,ZHAOAiguo,HUNa,LIULinlin,GURunguo

(1ShandongMedicalCollege,Linyi276000,China)

ObjectiveTo observe the influence of overexpression of miRNA-30a-5p on the proliferation and apoptosis of renal carcinoma cell line 786-0, and to explore the mechanism.MethodsThe renal carcinoma 786-0 cells were divided into the mimic group, the inhibitor group, and the non-transfected group. The cells in the mimic group were transfected with miRNA-30a-5p mimics, cells in the inhibitor group were transfected with miRNA-30a-5p inhibitor, and in the non-transfected group, the cells were normal renal carcinoma 786-0 cells. The expression of miRNA-30a-5p mRNA in the mimics group, inhibitor group, non-transfected group, and normal human renal tubular epithelial cells HK-2 (normal group) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR; the cell proliferation at 24, 48, and 72 h after transfection was evaluated by using CCK-8 assay; the apoptosis of the former three groups was assessed by flow cytometry; the expression of MTDH protein in the former three groups was detected by Western blotting.ResultsThe miRNA-30a-5p mRNA expression in the normal group, mimic group, inhibitor group, and non-transfected group was 1.00±0.00, 1.32±0.05, 0.32±0.05, and 0.52±0.06, respectively; significant difference was found between the normal group, mimic group, inhibitor group, and the non-transfected group (allP<0.01). The absorbance values of the normal group at 24, 48, and 72 h were 0.26±0.02, 0.44±0.03, and 0.73±0.06, respectively; the absorbance values of the mimic group were 0.33±0.04, 0.50±0.05, and 0.88±0.05, respectively; in the inhibitor group they were 0.86±0.01, 1.88±0.12, and 2.48±0.15, respectively; in the non-transfected group, they were 0.62±0.01, 1.63±0.02, and 2.34±0.23, respectively; significant difference was found between the normal group, the mimic group, and the inhibitor group and the non-transfected group at each time point, allP<0.01. The apoptosis rates in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 11.91%±0.45%, 5.23%±0.38%, and 6.77%±0.52%; significant difference was found between the mimic group and between the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01. The expression levels of MTDH protein in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 1.14±0.08, 6.31±0.24, and 5.56±0.06, and significant difference was found in the expression of MTDH protein of the mimic group as compared with that of the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01.ConclusionOverexpression of miRNA-30a-5p may inhibit 786-0 cell proliferation and promote the apoptosis by regulating the expression of MTDH.

renal cell carcinoma; micro RNA-30a-5p; cell proliferation ; apoptosis; metadherin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.007

R737.11

A

1002-266X(2017)38-0023-04

山東省高等學?？萍加媱濏椖?J13LL08);山東省臨沂市科技發(fā)展計劃項目(201515055)。

來衛(wèi)東(1978-)，男，副教授，主要研究方向為泌尿系腫瘤的分子機制。E-mail: lwddoctor@126.com

顧潤國(1966-)，男，教授，主要研究方向為泌尿系腫瘤的分子機制。E-mail: geda576@163.com

2017-04-10)