CRISPR-Cas技術(shù)在病原體核酸檢測中的研究進展*

張咪咪 綜述,劉家云,2△ 審校

1.陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)學院,陜西咸陽 712000;2.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科,陜西西安 710032

感染性疾病的病原體種類繁多,臨床最常見的有病毒和細菌等,它們具有易變異,致病性強,傳播速度快等特點,嚴重威脅人類健康[1]。目前全球感染性疾病的現(xiàn)狀不容樂觀,尤其是新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染暴發(fā)流行,凸顯了病原體的早期快速檢測對臨床診斷、預后判斷,以及指導用藥、控制傳播的重要性[2]。傳統(tǒng)的病原體檢測方法包括直接鏡檢、病原體分離與培養(yǎng)、抗原-抗體檢測、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等。目前實驗室最常用的核酸檢測技術(shù)是PCR,盡管其靈敏度高、特異性好,但存在實驗耗時長、檢測成本高,對實驗室環(huán)境、人員和設(shè)備要求高等不足[3]。因此,迫切需要開發(fā)出更簡便、快速的新型核酸診斷方法。近年來,基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR-Cas)的發(fā)現(xiàn)和深入研究給研究者帶來了希望[4-5]。2016年ABUDAYYEH等發(fā)現(xiàn)[6],Cas12具有“附帶切割”活性,即識別并結(jié)合到靶序列之后,Cas蛋白除可以特異性切除靶序列外,還會非特異性地切割熒光報告探針,釋放熒光信號,可以此達到檢測目的。此后,基于CRISPR-Cas的核酸檢測技術(shù)成為重要的研究方向之一。本文旨在對Ⅱ類CRISPR-Cas系統(tǒng)及其在感染性疾病核酸檢測方面的應(yīng)用現(xiàn)狀進行綜述。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)概述

1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)及分類 CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種RNA引導的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),包括重復序列與間隔序列交替出現(xiàn)的CRISPR序列及Cas蛋白,其通過在細菌宿主染色體中以病毒DNA的形式儲存記憶來阻止噬菌體感染[7-8]。該系統(tǒng)通過適應(yīng)、成熟、干擾3個階段發(fā)揮免疫功能。第一階段,當噬菌體或者病毒入侵時,細菌免疫防御機制激活,Cas蛋白剪切入侵基因的特定序列并將其整合到CRISPR序列中,以便再次入侵時能快速識別;第二階段,間隔序列翻譯成包含入侵序列的CRISPR核糖核酸(crRNA)和反式激活RNA (tracrRNA),二者通過堿基配對形成向?qū)NA(sgRNA),用于募集Cas蛋白;第三階段,當外源物再次入侵時,sgRNA與Cas蛋白結(jié)合成復合物,sgRNA通過序列互補捕捉靶標,Cas蛋白則發(fā)揮內(nèi)切酶活性進行切割,并在前間隔序列鄰近基序(PAM)的協(xié)助下,清除外來遺傳物質(zhì),發(fā)揮其免疫作用[9]。

Cas蛋白是具有目標依賴性的核酸酶,可由單個蛋白或者蛋白復合物組成。根據(jù)不同的Cas蛋白,將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類、6種類型、33種亞型和若干變種[10]。Ⅰ類系統(tǒng)由Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型組成,主要依賴由多個Cas蛋白和crRNA組成的復合物;Ⅱ類系統(tǒng)包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型,與Ⅰ類系統(tǒng)相比,Ⅱ類系統(tǒng)的效應(yīng)復合物是一個與crRNA結(jié)合的單一Cas蛋白[11]。由于Ⅱ類的CRISPR-Cas系統(tǒng)具有簡單且高效的特點,因此被廣泛應(yīng)用于基因編輯和分子診斷領(lǐng)域。CRISPR介導的適應(yīng)性免疫和一系列的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)和深入研究,不僅引領(lǐng)了基因編輯的變革,還推動了核酸檢測方法不斷推陳出新[12]。

1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)核酸檢測原理 CRISPR-Cas系統(tǒng)起初作為微生物、動植物系統(tǒng)中基因組編輯的有效工具,已逐漸成為傳統(tǒng)方法鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)等基因編輯方式的潛在替代品[13-14]。2012年MARTIN等[15]首次報告了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因組編輯潛力及其切割雙鏈DNA(dsDNA)的能力,并于2013年首次作為編輯基因組的工具應(yīng)用于哺乳動物細胞。目前關(guān)于基因組編輯的研究主要集中在病毒感染、心血管疾病(CVDs)、代謝紊亂、免疫系統(tǒng)缺陷、血友病等方面[16]。近年來,Cas13a(以前稱為C2c2)和Cas12a(以前稱為Cpf1)的RNA引導的核酸酶活性推動了新的核酸檢測工具的開發(fā)?；贑RISPR-Cas的核酸檢測技術(shù)主要是利用不同Cas蛋白的核酸酶活性。Ⅱ類Cas蛋白在核酸檢測中廣泛應(yīng)用,其原理也有所不同。其中,Cas9以基因編輯聞名,也可用于核酸檢測,它有2個結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC,且依賴3′端富含GC的PAM序列,通過sgRNA結(jié)合Cas9后識別并裂解dsDNA發(fā)揮其核酸酶活性[17]。Cas12a的結(jié)構(gòu)域為單個RuvC,依賴的PAM序列5′端富含AT,可以在crRNA的介導下識別并切割dsDNA,然后通過激活的“附帶切割”活性非特異性切割單鏈DNA(ssDNA)[18]。Cas13a靶向RNA且具有2個HEPN結(jié)構(gòu)域,其依賴的原間隔子側(cè)翼位點(PFS) 3′端可以是A、U或C,Cas13a一旦識別并切割由crRNA序列識別的RNA靶標,就轉(zhuǎn)入了一種酶促“激活”狀態(tài),將結(jié)合并切割其他的RNA,而不管是否與crRNA同源,或是否存在PFS[19]。最近發(fā)現(xiàn)的Cas14是一種靶向ssDNA的核酸酶,且體積比Cas9小1/2,可以在sgRNA引導下不依賴PAM發(fā)揮酶切作用[20]。上述幾種CRISPR-Cas系統(tǒng)的主要特征見表1。

2 CRISPR-Cas技術(shù)在感染性疾病核酸檢測中的應(yīng)用

2.1CRISPR-Cas9 Cas9自被發(fā)現(xiàn)以來,除了作為基因編輯中普遍使用的酶之外,也越來越廣泛地應(yīng)用于感染性疾病的診斷[21]。將其裂解功能與核酸擴增相結(jié)合,可檢測特異性核酸序列,用于病原菌基因分型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)鑒別。2016年,PARDEE等[22]將Cas9和核酸依賴擴增技術(shù)(NASBA)結(jié)合,借助Toehold生物傳感器建立了可肉眼判讀寨卡病毒檢測結(jié)果的平臺(NASBACC)。該平臺利用NASBA對目標RNA的高效擴增和CRISPR-Cas9可特異性識別靶標的優(yōu)勢,可在3 h內(nèi)鑒別寨卡病毒并對其進行基因分型。指數(shù)擴增反應(yīng)(EXPAR)是一種快速的等溫擴增技術(shù),但是和其他核酸擴增方法一樣存在非特異性擴增。2018年HUANG等[23]將CRISPR-Cas9與EXPAR聯(lián)合起來開發(fā)了Cas-EXPAR檢測系統(tǒng),用于李斯特菌的快速超敏檢測,該系統(tǒng)首先由CRISPR-Cas9切割產(chǎn)生目標DNA片段,然后通過EXPAR產(chǎn)生大量DNA,并通過實時熒光監(jiān)測方法檢測,它結(jié)合了CRISPR-Cas9和指數(shù)擴增的優(yōu)點,可以精準識別并切割目標,解決了EXPAR非特異性擴增的問題,提高了檢測的特異性和效率。

上述2個平臺都利用了Cas9特異性切割靶蛋白的特性,除Cas9之外,核酸酶失活的Cas9(dCas9)也被應(yīng)用于感染性疾病的診斷,不同的是研究者通過對Cas9的2個核酸酶結(jié)構(gòu)域進行突變,使其失去剪切能力但可以特異性結(jié)合靶蛋白[24-25]?；诖?GUK等[26]開發(fā)了一種基于DNA熒光原位雜交(FISH)的CRISPR傳感技術(shù),FISH已廣泛應(yīng)用于研究和診斷,可達到可視化結(jié)果的目的。該技術(shù)使用dCas9-sgRNA復合物作為靶標,通過特異性識別與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中與甲氧西林抗性有關(guān)的mecA來捕獲MRSA的基因組,因為大多數(shù)對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)的DNA菌株不含mecA基因,因此可用于檢測MRSA,通過熒光染料顯色來達到可視化的效果,且熒光強度可以反映MRSA的濃度。重要的是,通過簡單地改變sgRNA序列,本方法可以應(yīng)用于MRSA以外的任何目標序列。ZHANG等[27]開發(fā)一種RNA引導的成對dCas9(PC)報告系統(tǒng),用于結(jié)核分枝桿菌的檢測。該系統(tǒng)中的2個dCas蛋白分別與一分為二的熒光素酶相連,當2個dCas9同時識別并結(jié)合到靶標時,分開的兩部分熒光素酶會被拉近產(chǎn)生增強的熒光信號,以此來達到檢測目的。

上述這些技術(shù)所用的生物傳感器構(gòu)建過程相對復雜、需要一對Cas9/sgRNA、昂貴的熒光探針等成本較高,這阻礙了其廣泛應(yīng)用,特別是在即時檢測(POCT)中。基于此WANG等[28]開發(fā)一種快速、準確、便攜的核酸檢測平臺,最大限度地減少對設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的依賴,該技術(shù)的核心是將CRISPR-Cas9識別集成到側(cè)向流動檢測(LFA)平臺中,稱為CRISPR-Cas9介導的側(cè)向流動核酸測定法(CASLFA),可在1 h內(nèi)檢測鑒定產(chǎn)單核細胞李斯特菌、轉(zhuǎn)基因生物和非洲豬瘟病毒等。

表1 Ⅱ類CRISPR-Cas系統(tǒng)的主要特征

2.2CRISPR-Cas13 在CRISPR-Cas家族中,Cas13a是一種RNA引導的核酸酶,屬于Ⅵ型CRISPR-Cas系統(tǒng),可以在crRNA引導下特異性結(jié)合ssRNA,2016年被發(fā)現(xiàn)具有強大的“附帶切割”活性。張鋒團隊開發(fā)了第一個基于CRISPR-Cas13a的核酸檢測系統(tǒng)SHERLOCK,該系統(tǒng)使用重組酶聚合酶擴增(RPA)對靶標進行擴增,極大地提高了檢測的靈敏度,并在體系中加入熒光報告基團,通過產(chǎn)生可定量檢測的信號,實現(xiàn)標本DNA和RNA的單堿基分辨率檢測,該系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測寨卡病毒和登革病毒等[29]。2018年,GOOTENBERG等[30]開發(fā)了一種使用Cas13、Cas12a和CRISPR輔助相關(guān)酶Csm6的多路復用便攜式核酸檢測平臺,稱為SHERLOCK version 2(SHERLOCK v2),與一代平臺相比有以下優(yōu)點:(1)將Cas13a與Csm6聯(lián)合使用增強信號,使檢測靈敏度提高了3.5倍;(2)將等溫擴增時需要的引物稀釋后加入體系,避免了熒光報告基團飽和;(3)建立了基于LFA的便攜試紙條;(4)可實現(xiàn)了四通道多重檢測,這些優(yōu)勢使得SHERLOCK v2的應(yīng)用更加便捷和廣泛。之后,MYHRVOLD 等[31]開發(fā)出HUDSON法,通過將病毒顆粒裂解和核糖核酸酶失活的熱處理及化學處理與SHERLOCK相結(jié)合,可以在不經(jīng) DNA/RNA 提取和純化步驟的情況下裂解病毒,使SHERLOCK可以直接從臨床標本中檢測病毒核酸,極大地簡化了操作步驟。ARIZTI-SANZ等[32]將HUDSON進行優(yōu)化開發(fā)出SHINE法,其可以加速標本中的病毒失活,極大提高了診斷能力。

2020年SARS-CoV-2迅速傳播并導致全球大流行,雖然可以使用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)來診斷SARS-CoV-2感染,但由于試劑和設(shè)備的不足,在一定程度上減慢了疾病檢測的速度[33]。為了幫助推進SARS-CoV-2感染的診斷,JOUNG等[34]開發(fā)了一種基于SHERLOCK技術(shù)檢測SARS-CoV-2的方案,通過使用合成的SARS-CoV-2 RNA片段,能夠在1 h內(nèi)完成10-18mol/L的SARS-CoV-2靶序列檢測。

2.3CRISPR-Cas12 除了Cas13,基于Ⅱ類V-A型Cas12a也被發(fā)現(xiàn)具有“附帶切割”活性,然而與Cas13不同的是,Cas12a靶向DNA并“附帶切割”側(cè)支的ssDNA[35]?；谶@一特性,CHEN等[36]將Cas12a與等溫擴增結(jié)合起來建立了DETECTR平臺,可以準確快速檢測HPV16和HPV18 2種高危類型的人乳頭瘤病毒(HPV),這對于識別有相關(guān)癌癥風險的人群至關(guān)重要。與此同時,LI等[37]開發(fā)了HOLMES快速核酸檢測系統(tǒng),該平臺在Cas12a、crRNA和靶核酸形成復合物后,Cas12a的反式切割活性被激活,ssDNA報告基因被切割成小片段,報告基因可以用熒光物質(zhì)或生物素標記并通過生物傳感器達到可視化。目前的方法中,核酸擴增和基于CRISPR-Cas的靶標檢測是兩個獨立的步驟,需要將擴增產(chǎn)物與Cas檢測系統(tǒng)混合后進行,這會造成實際應(yīng)用的不便且標本間存在潛在交叉污染的可能。因此后續(xù)研究者在DETECTR的基礎(chǔ)上開發(fā)出了一種稱為Cas12aVDet的檢測方法,該方法通過將等溫擴增和Cas12a切割反應(yīng)整合在一個系統(tǒng)中,減小了污染的可能,縮短了檢測時間[38]。BROUGHTON等[39]開發(fā)了一種快速檢測SARS-CoV-2的DETECTR方法,該方法具有等溫信號放大系統(tǒng),不需要熱循環(huán),檢測時間短,單核苷酸靶標特異性,可視化側(cè)向流動條集成,不需要復雜的實驗室基礎(chǔ)設(shè)施等優(yōu)點,經(jīng)驗證,DETECTR檢測SARS-CoV-2的準確性與RT-qPCR相當,提示該技術(shù)可以為傳統(tǒng)檢測提供一種更加便捷、可視化的新方法。AI等[40]利用Cas12a建立了一種快速檢測臨床標本中結(jié)核分枝桿菌的方法,稱為CRISPR-MTB,與Xpert方法相比,CRISPR-MTB具有接近單拷貝的高靈敏度,需要的樣品更少,并且檢測周期更短。

除了Cas12a之外,Cas12b也被發(fā)現(xiàn)具有相同的“附帶切割”活性[41]。LI等[42]將CRISPR-Cas12b和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)聯(lián)合起來創(chuàng)建了改進版的HOLMESv2,結(jié)合了Cas12b的48 ℃高溫耐受性和LAMP可在42～65 °C達到60 min快速擴增的優(yōu)點,該系統(tǒng)可區(qū)分SNP,并將核酸擴增和目標檢測步驟整合到一個體系中,簡化了操作程序并避免交叉污染。2019年TENG等[43]通過優(yōu)化sgRNA,開發(fā)了基于Cas12b的DNA檢測方法(CDetection),這與之前報道的基于Cas12a的檢測平臺相比具有更高的靈敏度和特異性,為DNA檢測提供了一個高效且實用的平臺。之后,GUO等[44]通過將標本處理和核酸擴增方法與CDetection相結(jié)合,建立了一個集成的病毒核酸檢測平臺CASdetec(即CRISPR輔助檢測),該平臺將病毒處理、核酸擴增和基于CRISPR的檢測等程序在一個試管中運行,不需要打開蓋子即可在可見光下肉眼判讀結(jié)果,具有防止氣溶膠污染及降低假陽性率的優(yōu)點。CHEN等[45]基于CRISPR-Cas12b設(shè)計了一個乙型肝炎病毒(HBV)檢測平臺,稱為CRISPR-HBV,可對臨床上2種主要的HBV基因型(HBV-B 和 HBV-C)進行超靈敏、高特異性和快速檢測。

2.4CRISPR-Cas14 最近,發(fā)現(xiàn)了一種新的CRISPR-Cas14系統(tǒng),其中Cas14a可不依賴PAM特異性靶向ssDNA且體積更小,這使得Cas14a成為DNA檢測的另一個優(yōu)秀候選者。SAVAGE[46]在DETECTR的基礎(chǔ)上,將Cas12a替換成Cas14a,開發(fā)了Cas14-DETECTR系統(tǒng),該系統(tǒng)結(jié)合等溫擴增通過RPA和Cas14a高效檢測DNA,可誘導切割與熒光報道分子偶聯(lián)的ssDNA序列產(chǎn)生熒光信號。這種新的診斷技術(shù)已經(jīng)被證明可以準確檢測人類E3泛素蛋白連接酶(HERC2)基因,具有更強的特異性和“附帶切割”活性[47]。

3 CRISPR-Cas技術(shù)在病原體核酸檢測中的優(yōu)勢與局限

與傳統(tǒng)的診斷方法相比,CRISPR-Cas系統(tǒng)為病原體核酸檢測提供了新的思路。許多基于CRISPR的核酸檢測方法簡單便攜,不需要經(jīng)過嚴格培訓的人員及專門儀器和設(shè)備,檢測時間短,讀取結(jié)果簡單,靈敏度高,并且能夠滿足POCT的需要,還可以檢測未經(jīng)處理的和濃度極低的標本,這表明基于CRISPR-Cas技術(shù)的核酸檢測有廣闊的應(yīng)用前景[48]。部分基于CRISPR-Cas建立的核酸檢測平臺及其特點見表2。目前,傳統(tǒng)方法依然在臨床病原微生物的檢測方面發(fā)揮著重要作用,作為新興技術(shù)的CRISPR-Cas在核酸檢測中的優(yōu)勢在于核酸擴增后的進一步信號放大和信號轉(zhuǎn)化及輸出,尤其是Cas蛋白特異性識別擴增產(chǎn)物后所激活的“附帶切割”活性[49]。

然而,CRISPR-Cas技術(shù)也存在局限性:(1)序列限制。sgRNA正確識別靶標位點需要PAM序列,雖然這在某種程度增加了系統(tǒng)的特異性,但也降低了靶標區(qū)域選擇和sgRNA設(shè)計的靈活性;此外,不同種類的CRISPR類型和物種具有不同的PAM序列,這也使sgRNA的設(shè)計更復雜化。(2)定量分析。對于CRISPR-Cas13a檢測系統(tǒng),SHERLOCK平臺以其極高的靈敏度而備受青睞,然而,SHERLOCK在反應(yīng)開始后會迅速飽和,這使得實時準確定量非常困難,對于分子診斷,定量分析非常重要,且對于多種疾病來講定量可能是診斷所必需的,這就需要做更多的探索來尋找量化的方法[50]。(3)多重檢測。由于信號采集策略的限制且多個檢測步驟之間可能會存在干擾和交叉反應(yīng),從而影響了靈敏度和特異性,所以多重檢測仍具有相當?shù)奶魬?zhàn)性。(4)標準化。離子水平、環(huán)境溫度、pH值等許多因素可能會干擾效應(yīng)蛋白的裂解活性,從而使產(chǎn)生的信號發(fā)生變化,造成結(jié)果不準確,因此檢測系統(tǒng)的標準化就顯得更加重要[51]。

表2 基于CRISPR-Cas的核酸檢測平臺

4 總結(jié)與展望

近年來,CRISPR-Cas系統(tǒng)因為其高效性、便攜性和低成本的優(yōu)點,在基因組編輯方面有巨大貢獻,使得臨床疾病的診斷和治療發(fā)生了革命性的變化。自其“附帶切割”活性被發(fā)現(xiàn)之后,基于CRISPR-Cas系統(tǒng)檢測病原體核酸也進入高速發(fā)展期,開發(fā)的病原體檢測平臺逐步成為臨床中的有用工具。作為一個迅速興起的新技術(shù),CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)被用于操作培養(yǎng)細胞、編輯動物和植物的基因組,極大地加快了基礎(chǔ)研究的步伐,也使得農(nóng)業(yè)和合成生物技術(shù)取得突破性進展,目前也逐步進入一個新的時代,可嘗試將基因編輯技術(shù)用于患者體內(nèi)的致病基因的失活或修正,這將為遺傳性疾病患者提供一種全新的治療方案[52]。對于在2016-2019年基于Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)開發(fā)出的眾多平臺,通過不斷衍生發(fā)展,目前可以實現(xiàn)對包括寨卡病毒、瘧原蟲、HPV、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、非洲豬瘟病毒、SARS-CoV-2、HBV、人類免疫缺陷病毒(HIV)、登革熱病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體的高效和特異性檢測。同時,CRISPR-Cas技術(shù)也可用于發(fā)現(xiàn)新的疾病治療靶點和檢測生物標志物,這為腫瘤的早期診斷以及臨床治療提供了更加準確的科學依據(jù)和方法。目前臨床各種類型的耐藥越來越嚴重,包括對我國乃至全世界造成重要疫情的結(jié)核病,因此可以將CRISPR-Cas技術(shù)應(yīng)用于臨床細菌耐藥性檢測中,這對于緩解結(jié)核菌耐藥現(xiàn)狀,以及臨床常見的耐藥細菌感染至關(guān)重要。

綜上所述,CRISPR-Cas技術(shù)目前仍處于起步發(fā)展階段,在基于CRISPR的核酸檢測能夠完全取代PCR等已建立的核酸檢測技術(shù)之前,仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。但是,基于CRISPR-Cas的平臺展示了其優(yōu)越的性能,給核酸檢測帶來了革命性變化,相信通過不斷探索與改進,CRISPR-Cas技術(shù)將擁有更大的應(yīng)用潛力。