肺炎克雷伯菌莢膜血清型和耐藥基因型檢測(cè)及其耐藥機(jī)制研究

蘭 俊,侯 軒,王 輝,張清雯

三二〇一醫(yī)院:1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科;2.醫(yī)學(xué)微生物免疫科,陜西漢中 723000

有研究報(bào)道顯示,肺炎克雷伯菌感染已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)菌之一[1]。目前,臨床對(duì)于肺炎克雷伯菌感染患者的治療中,多選用頭孢類(lèi)及碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物。但是,臨床研究發(fā)現(xiàn),由于抗菌藥物的廣泛使用,病原菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。高黏液表型肺炎克雷伯菌(HMKP)是高毒力型病原菌的重要代表,隨著耐碳青霉烯類(lèi)-HMKP(CR-HMKP)的分離,其在臨床的遷徙性擴(kuò)散已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。正常生理狀態(tài)下,肺炎克雷伯菌存在于人體的上呼吸道、腸道中,當(dāng)機(jī)體的免疫力顯著下降時(shí),肺炎克雷伯菌可經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺內(nèi),最終造成肺大葉或者肺小葉的融合性病變[4]。研究證實(shí),HMKP在醫(yī)院內(nèi)已經(jīng)形成若干暴發(fā)流行[5]。但是,對(duì)于HMKP莢膜的血清學(xué)分析的研究較少[6]。本研究主要對(duì)肺炎克雷伯菌的血清型鑒定、耐藥基因型檢測(cè)及其耐藥機(jī)制進(jìn)行分析,以期為臨床診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2021年5月本院收治的240例HMKP感染者作為研究對(duì)象,其中CR-HMKP感染者49例(CR-HMKP組),非CR-HMKP類(lèi)感染者191例(非CR-HMKP組)。

1.2儀器與試劑 ExTaq酶及DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀由美國(guó)布魯克(Bruker)公司提供,全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀由美國(guó)BD公司提供,PCR儀由上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及HMKP分離 采集所有患者的痰液標(biāo)本,采用MALDI-TOF MS儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定,采用BD Phoenix M50 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程中,將標(biāo)本在生物安全柜中接種于血平板,使用接種環(huán)輕觸菌落表面,能拉起黏液絲長(zhǎng)度≥5 mm則為拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,可判定為HMKP。通過(guò)藥敏試驗(yàn)分析,對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的HMKP則為CR-HMKP[7]。

1.3.2耐藥及毒力基因檢測(cè) 分別對(duì)患者痰液的DNA進(jìn)行擴(kuò)增后,采用PCR及電泳方法對(duì)毒力基因(aerobactin、alls、mrkD、iroN、rmpA、magA、rmpB)、碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48)、質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、acc(6-IB-CR)]、ESBL基因(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV),以及16S核糖體RNA(rRNA)甲基化酶基因(rmtC、rmtB、armB、armA)進(jìn)行檢測(cè)?；驕y(cè)序均由深圳華大基因科技股份有限公司完成。

1.3.3質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn) 以臨床分離的CR-HMKP作為供體菌,使用大腸埃希菌J53作為受體菌,對(duì)于以上菌株進(jìn)行接種中國(guó)藍(lán)平皿后,在35 ℃下進(jìn)行孵育過(guò)夜,將活化后的菌株分別用生理鹽水調(diào)至0.5 MCF(麥?zhǔn)蠞岫葐挝?,取5 μL菌液在1 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行接種,在35 ℃下進(jìn)行孵育4 h,使用供體菌20 μL及受體菌40 μL按照1∶2進(jìn)行混合,接種于2 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯,在35 ℃下進(jìn)行孵育18 h,使用上述的混合液在篩選平皿中涂抹,在35 ℃下孵育過(guò)夜,再次挑選菌落轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)篩選平皿中,在35 ℃下孵育過(guò)夜。使用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定,采用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.3.4莢膜血清學(xué)分析 采用PCR儀檢測(cè)HMKP的K1、K2、K5、K20、K54、K57血清學(xué)分布。同時(shí),對(duì)肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因(rpoB、pgi、infB、gapA、phoE、mdh、tonB)進(jìn)行測(cè)序。

1.4觀察指標(biāo) (1)分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果,并比較CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑林、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟及阿米卡星的耐藥情況。(2)分析毒力基因分布結(jié)果,分別對(duì)CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP毒力基因aerobactin、alls、mrkD、iroN、rmpA、magA、rmpB的表達(dá)情況進(jìn)行比較。(3)分析耐藥基因分布情況,分別對(duì)CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP的blaKPC、blaNDM、blaCTX-M、blaSHV、qnrC、rmtB基因表達(dá)情況進(jìn)行比較。(4)分析莢膜血清學(xué)分布情況,分別對(duì)CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP的莢膜血清型K1、K2、K57分布情況進(jìn)行比較。(5)分析質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1兩組HMKP的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析 CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑林、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟及阿米卡星的耐藥情況比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組HMKP的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.2兩組毒力基因分布情況分析 CR-HMKP及非CR-HMKP組HMKP的aerobactin、alls、mrkD、iroN、rmpA、magA、rmpB 7個(gè)管家基因表達(dá)情況比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3兩組耐藥基因分布情況分析 CR-HMKP及非CR-HMKP組HMKP的blaKPC、blaNDM、blaCTX-M、blaSHV、qnrC、rmtB基因表達(dá)之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表2 兩組毒力基因分布情況分析[n(%)]

表3 兩組耐藥基因分布情況分析[n(%)]

2.4兩組莢膜血清學(xué)分布情況 CR-HMKP組及非CR-HMKP組HMKP的K1、K2、K57血清學(xué)分布情況比較,差異有在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

2.5質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)分析 質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)分析顯示,兩組HMKP對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑林、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟及阿米卡星的最小抑菌濃度(MIC)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表5。

表4 兩組莢膜血清學(xué)分布情況[n(%)]

表5 質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)抗菌藥物的

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示,肺炎克雷伯菌造成的呼吸道感染的發(fā)病率呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)[8]。從本院的研究資料來(lái)看,由CR-HMKP造成的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的比例較高,所以及時(shí)通過(guò)對(duì)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)的肺炎克雷伯菌感染及耐藥情況的分析,對(duì)于醫(yī)院內(nèi)感染控制工作的提升具有重要的意義。目前研究認(rèn)為,在肺炎克雷伯菌的感染過(guò)程中,頻繁使用抗菌藥物,大量生成的滅活酶可進(jìn)一步造成藥物抗菌活性的下降[9]。同時(shí),不當(dāng)使用抗菌藥物還會(huì)造成相關(guān)耐藥基因的激活,抗菌藥物的作用位點(diǎn)發(fā)生改變,進(jìn)而影響抗菌藥物發(fā)揮抗菌作用[10]。在患者治療過(guò)程中,耐藥菌株抗菌藥物外排泵的過(guò)度表達(dá),造成呼吸道感染患者靶點(diǎn)的藥物劑量降低,從而導(dǎo)致耐藥,影響患者的治療效果[11]。通過(guò)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床及時(shí)調(diào)整抗菌藥物治療方案,不僅對(duì)優(yōu)化醫(yī)療治療方案具有積極的意義,同時(shí)有利于患者治療效果的提升[12]。

在肺炎克雷伯菌感染過(guò)程中,莢膜是肺炎克雷伯菌感染的重要毒力因子,根據(jù)莢膜多糖建立的分型方法[13],可以將其分為不同的血清型,目前已知的血清型主要包括78個(gè),而納入本研究的K1、K2、K5、K20、K54、K57被認(rèn)為是高毒力肺炎克雷伯菌的主要血清型。既往研究中,K20被廣泛報(bào)道[14],同時(shí)K2血清型也在以往CR-HMKP感染中被發(fā)現(xiàn),而本研究中發(fā)現(xiàn)的莢膜血清型主要為K1、K2、K57,與以往的研究存在一定差異。分析認(rèn)為,造成此種差異的原因是不同地區(qū)人群的基因多態(tài)性[15]。對(duì)毒力基因分布結(jié)果分析顯示,發(fā)生CR-HMKP感染的患者主要表現(xiàn)為rmpA基因表達(dá)異常,提示在日后的臨床研究中,rmpA基因可作為本地區(qū)肺炎克雷伯菌感染藥物治療的重要靶向。本研究對(duì)耐藥情況的分析發(fā)現(xiàn),CR-HMKP對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑林、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟的耐藥情況均為100%,對(duì)阿米卡星的耐藥情況則較低。建議在臨床對(duì)此類(lèi)患者的治療中降低頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑林、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢吡肟等藥物的使用量,同時(shí)聯(lián)合使用多種抗菌藥物,降低耐藥性。

流行病學(xué)調(diào)查顯示,HMKP造成的感染可達(dá)到2%～18%[16],而目前國(guó)內(nèi)對(duì)于CR-HMKP造成呼吸道感染的區(qū)分的研究還較少,也缺乏對(duì)診療過(guò)程中呼吸道感染患者CR-HMKP的認(rèn)識(shí)[17]。但近年來(lái)的研究指出,CR-HMKP的耐藥率呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)[18]。隨著CR-HMKP感染風(fēng)險(xiǎn)的顯著升高,其較高的侵襲性及病死率使其已成為呼吸道感染的“超級(jí)細(xì)菌”[19]。因此,對(duì)患者耐藥情況進(jìn)行分析,及時(shí)調(diào)整治療方案,對(duì)于患者的治療具有積極意義[20]。

但是本研究還存在一定的局限性,納入研究的樣本量較小,同時(shí)CR-HMKP感染存在顯著的地域性差異,所以在對(duì)患者的治療中,對(duì)于不同地區(qū)的指導(dǎo)意義還有待在日后的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,肺炎克雷伯菌的莢膜血清型主要表現(xiàn)為K2,耐藥基因主要為rmtB,二者均可作為肺炎克雷伯菌感染者治療的重要靶點(diǎn)。