1例M蛋白干擾電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的處理與分析*

汪 玲,李慧明,張 慶,葉斌華,張 青△

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.核醫(yī)學(xué)科;2.檢驗(yàn)科,江西南昌 330006

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以單克隆漿細(xì)胞惡性增殖伴單克隆免疫球蛋白大量分泌為特征的惡性漿細(xì)胞病,產(chǎn)生的M蛋白沉積可引起患者骨質(zhì)破壞、腎功能損害、感染、貧血、高黏滯綜合征等多種非特異的復(fù)雜臨床表現(xiàn)。M蛋白具有獨(dú)特均一的物理特性,且多無免疫功能,但可在特定條件下干擾實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。近年來關(guān)于M蛋白干擾常規(guī)生化免疫檢測(cè)的報(bào)道屢見不鮮[1-2],涉及比色法及濁度法等多種生化免疫分析方法,亦有M蛋白在化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)中產(chǎn)生干擾的案例[3]。M蛋白根據(jù)免疫球蛋白的類型可分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD,以及輕鏈型、雙克隆型和不分泌型。產(chǎn)生檢測(cè)干擾的免疫球蛋白以IgG和IgM為主,IgA型M蛋白雖在臨床發(fā)病率較高,但發(fā)生檢測(cè)干擾的現(xiàn)象十分罕見。本文報(bào)道了本院近期發(fā)現(xiàn)的1例IgA型M蛋白干擾維生素B12(VB12)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的個(gè)案及消除干擾的方法。

1 資料與方法

1.1臨床資料 患者,男,49歲,雙眼視力無痛性下降10 d,加重6 d伴乏力,擬以“糖尿病性視網(wǎng)膜病變(雙)”收入本院眼科治療。既往發(fā)現(xiàn)有糖尿病史10余天,口服格列美脲,1片/次,1次/天。查體示神清,精神差,自主體位,中度貧血貌;鼻腔牙齦有出血;全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。多層螺旋CT掃描顯示雙側(cè)多根肋骨骨質(zhì)破壞并軟組織腫塊,多個(gè)胸椎體及附件、左側(cè)肩胛骨內(nèi)斑片狀低密度影,考慮惡性病變。實(shí)驗(yàn)室檢查血常規(guī)示:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)2.89×109/L,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)1.69×1012/L,血小板計(jì)數(shù)(PLT) 93×109/L,血紅蛋白(Hb)53 g/L,平均紅細(xì)胞體積(MCV)107.1 fL,平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)31.4 pg,平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)293 g/L;生化指標(biāo):總蛋白(TP)138.9 g/L,清蛋白(ALB)25.0 g/L,球蛋白(GLB) 113.9 g/L,ALB/GLB 0.22,肌酐(CR)111.1 μmol/L,尿酸(UA)475.7 μmol/L;免疫球蛋白+補(bǔ)體:IgG 5.20 g/L,IgA 88.40 g/L,IgM 0.17 g/L;貧血三項(xiàng)檢測(cè):鐵蛋白619.70 μg/L,葉酸12.05 ng/mL,VB12不能檢測(cè),儀器報(bào)警“標(biāo)本有凝塊”;血清蛋白電泳:γ球蛋白70.7%;免疫固定電泳:IgA,κ泳道發(fā)現(xiàn)異常條帶,分型為IgAκ型;游離輕鏈檢測(cè):游離κ輕鏈>183.00 mg/L;輕鏈κ 9 740.00 mg/dL;骨髓瘤免疫分型可見31.43%異?？寺⌒詽{細(xì)胞;骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)考慮MM骨髓象。臨床主要診斷為MM(IgAκ型)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理 使用分離膠真空采血管采集患者肘部靜脈5 mL,室溫放置待血液完全凝固后3 000 r/min離心5 min,收集血清,血清鐵蛋白、葉酸和VB12檢測(cè)均采用羅氏Cobas e602全自動(dòng)免疫分析儀(電化學(xué)發(fā)光法),檢測(cè)試劑均采用原裝配套試劑。

1.2.2確認(rèn)干擾VB12檢測(cè)原因 VB12檢測(cè)時(shí)儀器報(bào)警“標(biāo)本有凝塊”結(jié)合該患者血液樣本試管存在分離膠不翻轉(zhuǎn)上浮的現(xiàn)象,考慮以下原因:(1)樣本量太少;(2)真空管分離膠質(zhì)量問題;(3)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速不夠?qū)е卵逦赐耆龀?(4)患者標(biāo)本中存在異常的血液成分。為探究干擾原因,統(tǒng)計(jì)近3天分離膠不翻轉(zhuǎn)的標(biāo)本例數(shù),加大樣本離心轉(zhuǎn)速至分離膠上浮,分離出血清后再進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3消除干擾的方法 稀釋法:根據(jù)羅氏VB12試劑說明書建議的稀釋基質(zhì),分別采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)對(duì)患者血清進(jìn)行倍比稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32),并比較兩種稀釋方式所換算的VB12檢測(cè)值。聚乙二醇 PEG6000 蛋白沉淀法:將250 g/L PEG6000與患者血清等比例混合,渦旋30 s,室溫下靜置15 min,以 10 000×g離心5 min,取上清液檢測(cè)VB12,同時(shí)選取5份非免疫球蛋白增高的患者標(biāo)本作為對(duì)照,計(jì)算此方法的樣本回收率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩種基質(zhì)稀釋后的檢測(cè)結(jié)果,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1近3天分離膠不翻轉(zhuǎn)標(biāo)本統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)核醫(yī)學(xué)科近3天5 028例患者血液標(biāo)本發(fā)現(xiàn)分離膠不上浮標(biāo)本3例,只占總例數(shù)的0.06%。

2.2加大離心機(jī)轉(zhuǎn)速至分離膠上浮后的檢測(cè)結(jié)果 將離心機(jī)轉(zhuǎn)速由3 000 r/min提高至4 200 r/min(離心時(shí)間5 min)時(shí),試管分離膠上浮,析出足量清亮、透明血清,無肉眼可見凝塊;將樣本再次上機(jī)檢測(cè),VB12仍不能檢測(cè),儀器報(bào)警提示“標(biāo)本有凝塊”。

2.3兩種基質(zhì)稀釋的VB12檢測(cè)結(jié)果比較 采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)兩種基質(zhì)倍比稀釋后,所換算的VB12檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種基質(zhì)稀釋的VB12檢測(cè)結(jié)果比較(pg/mL)

2.4PEG6000蛋白沉淀法結(jié)果及回收率 蛋白沉淀法VB12檢測(cè)換算值(檢測(cè)值×2)為918.2 pg/mL,5份對(duì)照患者標(biāo)本的回收率分別為94.3%、103.5%、93.5%、92.2%和91.2%,見表2。樣本回收率高,提示該方法處理樣本所得測(cè)定值可靠。

表2 PEG6000蛋白沉淀法VB12檢測(cè)結(jié)果及對(duì)照標(biāo)本回收率

3 討 論

VB12也稱鈷銨素,是一種水溶性的有機(jī)金屬化合物,人體不能合成,其主要來源于肉蛋奶及魚類制品。人體胃腸道對(duì)VB12的吸收取決于胃壁細(xì)胞合成的內(nèi)因子。貧血是MM患者的常見癥狀,血清VB12缺乏在MM貧血患者中普遍存在[4],故檢測(cè)MM患者的血清VB12水平十分重要。

患者標(biāo)本VB12檢測(cè)時(shí)儀器報(bào)警提示“標(biāo)本有凝塊”,結(jié)合分離膠采血管血液分離異常,分離膠未上浮的現(xiàn)象,筆者統(tǒng)計(jì)近3天核醫(yī)學(xué)科患者標(biāo)本分離膠未上浮比例僅為0.06%,初步排除離心機(jī)的轉(zhuǎn)速不夠的推測(cè),若為分離膠質(zhì)量問題,會(huì)出現(xiàn)此批次大量分離膠不上浮的情況,排除分離膠質(zhì)量問題;加大標(biāo)本離心轉(zhuǎn)速后分離膠上浮,血清析出,但VB12仍未檢出,提示患者血液標(biāo)本可能存在異常血液成分使血清密度增加。

MM產(chǎn)生的大量M蛋白會(huì)引起血清蛋白質(zhì)成分的變化,進(jìn)而導(dǎo)致血清密度增加[5]。多中心臨床研究發(fā)現(xiàn),MM患者大多存在分離膠位置改變的血液分離不良現(xiàn)象,此現(xiàn)象可提示MM的診斷[6]。該患者血液中存在大量IgA型M蛋白,易形成二聚體為主的多種聚合體,以聚合物形式存在的M蛋白可使患者出現(xiàn)黏滯血癥,干擾檢測(cè)吸樣[7];羅氏Cobas e602標(biāo)本針吸取樣本為壓力感應(yīng),吸樣時(shí)阻力超出閾值即引起儀器報(bào)警,此阻力大小與樣本的吸樣量有關(guān),因此只造成了VB12檢測(cè)報(bào)警。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,采用稀釋法和聚乙二醇PEG6000蛋白沉淀法對(duì)樣本進(jìn)行處理以消除M蛋白對(duì)檢測(cè)的干擾[8]。為最大限度地降低“基質(zhì)效應(yīng)”引起的VB12檢測(cè)誤差,采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清分別進(jìn)行稀釋檢測(cè),結(jié)果表明兩種基質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果無明顯差異,但兩種基質(zhì)的倍比稀釋結(jié)果呈現(xiàn)非線性,筆者暫無法判斷此結(jié)果是“基質(zhì)效應(yīng)”的影響還是血清中高濃度M蛋白對(duì)VB12檢測(cè)的內(nèi)源性干擾。蛋白沉淀法對(duì)照標(biāo)本蛋白沉淀法的回收率為91.2%～103.5%,回收率高,該方法處理樣本后的測(cè)定值可靠;以蛋白沉淀法檢測(cè)結(jié)果為參照,比較倍比稀釋結(jié)果,筆者發(fā)現(xiàn)低稀釋倍數(shù)時(shí)VB12檢測(cè)結(jié)果異常增高,但隨著稀釋倍數(shù)增加其檢測(cè)值與蛋白沉淀法結(jié)果一致,無明顯“基質(zhì)效應(yīng)”,該患者血清IgA的質(zhì)量濃度為8.84 g/dL,遠(yuǎn)高于VB12試劑說明中抗IgA干擾上限1.6 g/dL,推測(cè)稀釋法檢測(cè)結(jié)果不成線性的主要原因是:低稀釋倍數(shù)時(shí),高濃度的M蛋白會(huì)干擾VB12檢測(cè)。

VB12檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)法的原理,使用VB12特異性內(nèi)因子,樣本中的VB12與加入的生物素標(biāo)記的VB12競(jìng)爭(zhēng)釕標(biāo)記的內(nèi)因子復(fù)合物上的結(jié)合位點(diǎn)。有案例曾報(bào)道,IgGκ型M蛋白對(duì)VB12增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法的干擾作用,高水平的M蛋白可與內(nèi)因子非特異性結(jié)合[9],M蛋白可占據(jù)內(nèi)因子上的結(jié)合位點(diǎn),孵育時(shí)內(nèi)因子上能夠與生物素標(biāo)記的VB12結(jié)合的空位減少,導(dǎo)致發(fā)光信號(hào)降低,使得檢測(cè)結(jié)果假性增高。

綜上所述,本案例中IgAκ型的M蛋白不僅干擾VB12的檢測(cè)吸樣,同時(shí)造成稀釋后的VB12檢測(cè)結(jié)果假性增高;低倍數(shù)的稀釋法難以消除M蛋白干擾,測(cè)定結(jié)果不可靠,隨著稀釋倍數(shù)增加,M蛋白的干擾作用會(huì)減弱。但稀釋法的效果取決于稀釋倍數(shù)和取樣準(zhǔn)確性,也需要考慮稀釋介質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng),不能一概否定此方法。因此,日常檢測(cè)工作中要重視M蛋白對(duì)免疫檢測(cè)的干擾作用,當(dāng)檢測(cè)出現(xiàn)異?；蚪Y(jié)果與臨床征象不相符時(shí),要與臨床醫(yī)生及時(shí)溝通,避免發(fā)出錯(cuò)誤結(jié)果。