高通量測(cè)序技術(shù)在B族鏈球菌鑒別分型中的研究進(jìn)展*

易樂(lè)暉,王飛玲 綜述,吳麗娟,3△ 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū),廣東珠海 519000;2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科,廣東深圳 518106;3.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院母胎醫(yī)學(xué)研究所,廣東深圳 518106

B族鏈球菌(GBS)是圍生期母嬰感染首位病原菌,可導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒侵襲性GBS感染[1]。孕產(chǎn)婦陰道和直腸的GBS定植率可達(dá) 15%～30%,約50% GBS定植孕產(chǎn)婦在分娩時(shí)會(huì)經(jīng)產(chǎn)道傳播GBS給新生兒,1%～2%新生兒表現(xiàn)為侵襲性感染[2]。當(dāng)前,新生兒GBS感染防控主要基于產(chǎn)婦陰道定植GBS菌株的篩查模式[3],對(duì)GBS定植母親分娩時(shí)使用抗菌藥物,可顯著減少新生兒侵襲性GBS感染的發(fā)生率[4];但也有研究者質(zhì)疑普遍篩查的有效性和獲益[5],認(rèn)為99.8%的GBS篩查陽(yáng)性產(chǎn)婦及其新生兒被不必要地使用了抗菌藥物,探索更精準(zhǔn)的預(yù)防篩查手段是臨床檢驗(yàn)的重要方向[6-7]。近10年,國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)GBS菌株進(jìn)行毒力基因篩選、鑒別分型及分子進(jìn)化等研究,并取得了積極進(jìn)展。本文著重探索不同類型的高通量測(cè)序技術(shù)在GBS鑒別分型中的應(yīng)用價(jià)值,以加深和拓寬對(duì)GBS致病機(jī)制和分子流行病學(xué)的認(rèn)識(shí),為圍生期GBS感染從菌株模式廣泛篩查到分子模式精準(zhǔn)診斷奠定基礎(chǔ)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)概述

基于二代測(cè)序(NGS)和三代測(cè)序的高通量測(cè)序技術(shù),結(jié)合不同的應(yīng)用需求,衍生出多種測(cè)序方法,本文涉及的多種測(cè)序技術(shù)的原理簡(jiǎn)介及應(yīng)用場(chǎng)景見(jiàn)表1。

2 高通量測(cè)序技術(shù)在GBS鑒別分型中的研究進(jìn)展

2.1基于樣本的直接GBS鑒別和分型 16S核糖體RNA(16S rRNA)測(cè)序和宏基因組測(cè)序(mNGS)技術(shù)均在非培養(yǎng)方法檢出及鑒定GBS中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。妊娠期陰道微生態(tài)菌群相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),mNGS或16S rRNA測(cè)序可鑒別GBS,但尚未統(tǒng)計(jì)檢出率,也未進(jìn)一步對(duì)GBS進(jìn)行分型[12];有研究發(fā)現(xiàn),16S rRNA測(cè)序相較于巢式PCR和定量PCR(qPCR)方法對(duì)胎盤中的GBS檢出率更高,研究認(rèn)為與胎盤中GBS的菌量有關(guān),當(dāng)菌量較少時(shí)用16S rRNA檢測(cè)可能更靈敏,通過(guò)對(duì)另一組去除污染菌影響的胎盤樣本進(jìn)行2次16S rRNA測(cè)序,在5%分娩前孕產(chǎn)婦的胎盤中鑒別出了GBS[13]。已有研究證實(shí),mNGS可在腦脊液中檢出包括GBS在內(nèi)的多種病原菌,對(duì)兒童細(xì)菌性腦膜炎具有早期診斷價(jià)值[14-15]。另外,在培養(yǎng)陰性的感染性心內(nèi)膜炎患者血液樣本和心臟瓣膜樣本中,采用mNGS均鑒定出了GBS[16]。

2.2基于菌株的WGS與GBS分型 基于GBS全基因組信息,WGS既可分析傳統(tǒng)的分子流行病學(xué)信息,如血清型和基因型,也可進(jìn)一步分析其克隆傳播特點(diǎn)并挖掘潛在未知信息。莢膜多糖(CPS)是GBS導(dǎo)致侵襲性疾病的重要毒力因素和疫苗靶標(biāo),據(jù)其不同可將GBS分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ 10種血清型[17],正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段的六價(jià)CPS結(jié)合疫苗可覆蓋Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅴ 6種主要莢膜血清型。美國(guó)各年齡段來(lái)源的6 340株和英國(guó)410株新生兒侵襲性菌株的WGS測(cè)序結(jié)果均顯示Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ和Ⅴ這5～6種血清型占比超過(guò)98%[18-19],導(dǎo)致新生兒早發(fā)和晚發(fā)型疾病的Ⅲ型菌株分別占27.2%和69%,成人Ⅰa型菌株占比20.36%[18]。早期基因分型通常是基于7個(gè)管家基因的擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)行的多種序列分型(MLST)方法,按照等位基因的相似性將各種序列型(ST)進(jìn)行克隆復(fù)合體(CC)歸類[18]。core genome MLST(cgMLST)是根據(jù)GBS核心基因組序列進(jìn)行分型,比MLST分辨率更高[20]。全球198項(xiàng)關(guān)于GBS的研究中,有1/4的研究包含了MLST,但WGS相關(guān)研究不足5%[21],基于WGS可以完成MLST和cgMLST分型[18,22]。有研究已證實(shí),相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,WGS不僅能更準(zhǔn)確對(duì)GBS血清型和基因型進(jìn)行分型,還可以分析莢膜置換和不可分型的原因,并具有發(fā)現(xiàn)新的血清型或基因型及其相關(guān)突變的優(yōu)勢(shì)[22]。根據(jù)GBS群體的WGS發(fā)現(xiàn),單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異不僅可以完成系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析,也可用于比較GBS菌株之間的克隆傳播特點(diǎn)及關(guān)系,有研究認(rèn)為,SNP差異為0的菌株遺傳上相同,SNP差異≤5的菌株遺傳上高度相似,可判斷為克隆傳播[19]。

2.3基于WGS分析GBS菌株的耐藥性 GORI等[23]通過(guò)WGS首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)四環(huán)素的廣泛使用可導(dǎo)致攜帶四環(huán)素耐藥基因整合元件(ICE)的CC17菌株在全球流行,新生兒GBS感染率升高,大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥導(dǎo)致CC1型菌株增加。WGS還檢測(cè)到青霉素結(jié)合蛋白(PBP)2X突變菌株、攜帶萬(wàn)古霉素耐藥基因vanY的CC23菌株和vanG的Ⅱ/ST22、Ⅴ/ST1 GBS菌株,使得GBS對(duì)β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物和萬(wàn)古霉素敏感性下降[18,24-25]。我國(guó)也有研究基于WGS獲取GBS全部耐藥信息并檢出多種多重耐藥簇[26-27]。

2.4WGS鑒別與篩選GBS侵襲性相關(guān)毒力基因 目前GBS確切致病的分子機(jī)制尚不明確,多數(shù)研究表明,GBS的高致病性與多種毒力基因有關(guān),利用WGS檢測(cè)并鑒別與GBS侵襲致病相關(guān)的毒力基因,可進(jìn)一步分析并預(yù)測(cè)基因功能。WGS檢測(cè)全球901株不同宿主的侵襲性GBS菌株,發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)快速獲得或缺失基因適應(yīng)新宿主或生態(tài)位環(huán)境,幾乎所有的菌株有一或多個(gè)遺傳移動(dòng)元件(MGE)和致病菌毛島(PI),如PI-1、PI-2a和PI-2b[28]。WGS在美國(guó)最大樣本量的侵襲性GBS菌株中幾乎都檢測(cè)到與毒力相關(guān)的PI、α蛋白家族基因以及srr1和srr2基因[18]。利用泛基因組關(guān)聯(lián)研究分析1 988株侵襲和定植GBS菌株基因序列的多樣性,最終在279個(gè)致病特異基因聚集的5種不同功能的CC中檢測(cè)到與GBS代謝及人類患病相關(guān)基因多見(jiàn)于CC17(gcc1732、lepB、inLA_2、gcc1733)和CC23(mntH),其中參與GBS定植、GBS與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)特定生態(tài)位和代謝等多種途徑的基因存在差異,并發(fā)現(xiàn)CC17菌株的16個(gè)特異基因的等位變異在侵襲和定植菌株中顯著不同[24]。有研究進(jìn)一步證實(shí)了CC17型定植和侵襲GBS菌株有14個(gè)基因突變存在SNP差異,確定侵襲菌株致病的關(guān)鍵且特異的基因srr2存在SNP差異,侵襲菌株通過(guò)交換染色體片段以適應(yīng)不同宿主環(huán)境,在人類宿主中顯示出較強(qiáng)的傳播力,并在歐洲、北美、非洲及亞洲地區(qū)廣泛傳播[29]。

2.5RNA-seq鑒別GBS毒力基因 RNA-seq篩選GBS如何在轉(zhuǎn)錄組層面調(diào)節(jié)基因表達(dá)適應(yīng)新的宿主環(huán)境和致病,常通過(guò)比較分析突變菌株和野生菌株的轉(zhuǎn)錄組或不同環(huán)境下的菌株轉(zhuǎn)錄組來(lái)實(shí)現(xiàn)。我國(guó)在魚(yú)類GBS中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種新型XRE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(XtgS),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)感染缺失XtgS 因子的菌株較野生型菌株死亡率低,可能其是GBS致病的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,RNA-seq發(fā)現(xiàn)缺失XtgS的菌株有74和21個(gè)基因分別參與上調(diào)和下調(diào),這些基因與噬菌體、膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)生物合成等過(guò)程有關(guān)[30]。Cas9是規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)中的核酸內(nèi)切酶之一,通過(guò)降解DNA對(duì)GBS毒力基因起調(diào)節(jié)作用,小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示Cas9突變菌株較野生型菌株毒力弱,RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)參與代謝、毒力、細(xì)胞壁形成有關(guān)的基因以及雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCS)中的CiaR因子顯著失調(diào),證實(shí)CiaR因子可促進(jìn)GBS在陰道定植,對(duì)CiaR突變菌株RNA-seq顯示有25和33個(gè)基因分別參與上調(diào)和下調(diào),這些基因包括了Cas9突變體中的上調(diào)和下調(diào)基因,說(shuō)明Cas9可以通過(guò)其他因子調(diào)節(jié)GBS基因表達(dá)[31]。研究表明,高濃度鋅離子不利于野生Ⅲ/ST17型GBS菌株生存,對(duì)生存在不同濃度鋅離子環(huán)境的菌株進(jìn)行RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),包括czcD、nikABCD、mntH2和 mtsABC基因在內(nèi)的229個(gè)基因和adcA基因在內(nèi)的238個(gè)基因分別參與上調(diào)和下調(diào),與GBS抵抗宿主來(lái)源蛋白的活性有關(guān)[32]。值得注意的是,RNA測(cè)序往往需要RT-qPCR來(lái)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6Tn-seq鑒別篩選GBS必需基因 Tn-seq可篩選GBS在某種特定生長(zhǎng)環(huán)境中生存所需的基因,研究WGS中單個(gè)基因的適應(yīng)度,以及基因之間的相互作用關(guān)系,還可識(shí)別潛在抗體靶標(biāo)。HOOVEN等[33]首先建立并初步評(píng)估了一種基于GBS菌株A909的轉(zhuǎn)座子文庫(kù),對(duì)其應(yīng)用Tn-seq篩選出A909生存的必需基因占基因組比例為13.5%,關(guān)鍵基因占比為1.2%。目前該團(tuán)隊(duì)還應(yīng)用該文庫(kù)和Tn-seq對(duì)A909在血液和羊水中生存的必需基因進(jìn)行篩選,并進(jìn)一步完成對(duì)篩選出的個(gè)別必需基因進(jìn)行基因敲除及RNA測(cè)序等功能驗(yàn)證[34-35]。ZHU等[36-37]利用Tn-seq篩選Ⅴ型GBS菌株在全血和血漿中存活的重要基因aroA、metP和mtsA,其中aroA基因是必需基因,W903_1820是該GBS菌株在全血中生長(zhǎng)的必需基因;另外,對(duì)GBS細(xì)胞壁肽聚糖生物合成起催化作用的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)進(jìn)行研究,構(gòu)建野生型菌株和4種pbp(pbp1A、pbp1B、pbp2A、pbp2B)突變菌株文庫(kù),經(jīng)Tn-seq篩查5種菌株中共有350個(gè)必需基因,并發(fā)現(xiàn)某種pbp突變菌株需要其他pbp作為必需基因。Tn-seq在GBS基因組中的基因飽和度不夠高(39%～46%),近期有研究對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行CRISPR測(cè)序,體現(xiàn)出比Tn-seq更大的優(yōu)勢(shì),可檢測(cè)所有基因的適應(yīng)度,但目前尚未將這一技術(shù)應(yīng)用于GBS相關(guān)研究[33,38]。

3 小結(jié)與展望

對(duì)各種類型的人體樣本采用非培養(yǎng)方法直接16S rRNA測(cè)序或mNGS,數(shù)據(jù)處理時(shí)即可完善GBS鑒別及分型分析,可初步鑒別出臨床重要分型的GBS,更有望全面了解GBS的微生態(tài)分布特點(diǎn)?；贕BS菌株的WGS已篩選鑒別出較多的與致病性和流行傳播相關(guān)的毒力基因或分型靶標(biāo),可進(jìn)一步應(yīng)用于疫苗及診斷方法的設(shè)計(jì)。應(yīng)用RNA-seq、Tn-seq篩查GBS可能的毒力調(diào)控基因及必需基因等可更全面了解其致病機(jī)制。高通量測(cè)序技術(shù)支撐和推動(dòng)了GBS鑒別分型的精準(zhǔn)分子診斷,我國(guó)目前仍較缺乏高通量測(cè)序技術(shù)在GBS的致病機(jī)制或分子流行病學(xué)中的應(yīng)用研究數(shù)據(jù),期待未來(lái)更快速、簡(jiǎn)潔的高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及標(biāo)準(zhǔn)化、可視化的生物信息學(xué)分析的普及,為臨床防治GBS感染做出新貢獻(xiàn),也對(duì)未來(lái)微生物檢驗(yàn)的發(fā)展提供新思路。