澳洲堅(jiān)果光殼種MiSAD的克隆與表達(dá)

楊倩　楊子平　鄒明宏　宋喜梅　萬繼鋒　陳 菁　羅煉芳　曾輝

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果；硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S664.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

澳洲堅(jiān)果（M. integrifolia），又稱夏威夷果，原產(chǎn)于澳大利亞，在熱帶和亞熱帶地區(qū)多有種植[1]，中國目前已經(jīng)成為澳洲堅(jiān)果種植面積最大的國家。澳洲堅(jiān)果屬于山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬，主要有4 個(gè)種，即M. integrifolia Maiden & Betche、M.tetraphylla L. A. S. Johnson、M. ternifolia F. Mueller和M. jansenii C. L. Gross & P. H. Weston，僅有光殼種（M. integrifolia）和粗殼種（M. tetraphylla）及其雜交種用于商業(yè)性栽培。澳洲堅(jiān)果果仁不僅風(fēng)味獨(dú)特，而且具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素（錳、鐵、鎂）、維生素（B6）和微量元素[2]。研究表明，成熟的澳洲堅(jiān)果中總油脂的含量最高可達(dá)80.3%，主要包含油酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、二十碳烯酸、肉豆蔻酸和二十一烷酸等，其中油酸、棕櫚油酸和二十碳烯酸是大含量脂肪酸，可以占到總脂肪酸的87.52%[3]，澳洲堅(jiān)果是重要的單不飽和脂肪酸來源植物，也是新興的木本油料作物，但其遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立，關(guān)于澳洲堅(jiān)果果仁中不飽和脂肪酸生物合成和積累的分子機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

植物硬脂酰-?；d體脫飽和酶（ stearoylacyl-carrier- protein desaturase， SAD）是質(zhì)體中脂肪酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化硬脂酰-ACP 在第9 位至第10 位碳原子之間脫飽和形成雙鍵[4]，是產(chǎn)生不飽和脂肪酸的關(guān)鍵步驟。因此，植物SAD 酶是產(chǎn)生油酸和多不飽和脂肪酸的前提，大量研究表明，植物SAD 基因能夠顯著調(diào)控植物中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例[5-6]。LIN 等[7]通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果SAD基因家族存在12 個(gè)成員，GUMMESON 等[8]和RODR?GUEZ 等[9]早期從澳洲堅(jiān)果中分離到一個(gè)與不飽和脂肪酸生物合成相關(guān)的脫飽和酶基因，酶活試驗(yàn)表明澳洲堅(jiān)果SAD 脫飽和酶能夠催化硬脂酰-ACP （ 18：0-ACP ） 和軟脂酰-ACP（16：0-ACP）轉(zhuǎn)化成C18：1-ACP 和C16：1-ACP，經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)與12 個(gè)成員之一的MiFAB2.12一致，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本研究開展澳洲堅(jiān)果光殼種SAD 基因的克隆，并分析其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特征，為研究澳洲堅(jiān)果SAD 基因功能和脂肪酸生物合成（積累）分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為澳洲堅(jiān)果光殼種‘南亞1 號(hào)，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所的國家熱帶植物種質(zhì)資源庫——澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源圃（中國廣東省湛江市）。根取自‘南亞1 號(hào)種子萌發(fā)的實(shí)生幼苗的新鮮幼根；莖、葉取自“南亞1 號(hào)”果樹上當(dāng)年新生的嫩葉和嫩莖；花取自‘南亞1 號(hào)果樹花序上的全部小花混合。分別收集澳洲堅(jiān)果開花后第45、68、75、86、95、100、117、126、139、146、168、177、188、195、201天的果仁。所有樣品采集后，盡快使用液氮速凍，直接用于DNA/RNA提取或者保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

Plant Total RNA Isolation Kit Plus 購自天根生化科技（北京）有限公司。MonAmp? 2× MonHI-FIMix 、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 、Taq SYBR Green qPCR Premix ROXⅠ（NOVA）購自莫納公司。PCR 產(chǎn)物純化、凝膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。引物合成與DNA 測序委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 合成 澳洲堅(jiān)果葉片總RNA 提取按照Plant Total RNA Isolation KitPlus 方法進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄按照All-in-One First-StrandSynthesis Master Mix 操作。反應(yīng)體系為：All-in-One First-Strand Synthesis Master Mix 4μL，RNA 模板50 ng～1 μg，dsDNase μL，Nuclease-free water 加至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃ 10 min，55℃ 30 min，85℃ 1 min。

1.2.2 澳洲堅(jiān)果SAD 基因全長及cDNA 序列克隆根據(jù)澳洲堅(jiān)果基因組CDS 數(shù)據(jù)[10]，設(shè)計(jì)擴(kuò)增SAD編碼框的引物（SAD-F：ACAGCAATGGCTCTCAAGCTTA；SAD-R：CCCTTCTACTCAGCTTCCATTCTG）。根據(jù)澳洲堅(jiān)果基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增SAD 基因組序列的引物（MiSAD-F51：CGAAAGAAAGAGTGAGTAGGC；MiSAD-R6997：ACAACAATGCCAACGGAG）。PCR 反應(yīng)體系為：上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，MonAmp? 2×MonHI-FI Mix 10.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增SAD 編碼框的程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增SAD 基因組序列的程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化，連接至T 載體，連接體系為：T 載體0.5 μL，DNA Ligase 0.5 μL，PCR 產(chǎn)物4.0 μL，2×Ligation buffer 5.0 μL，ddH2O 將體系補(bǔ)足至10.0 μL 體系。室溫25℃ 5 min 即可完成連接反應(yīng)。隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，以含氨芐青霉素的抗性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，對陽性克隆測序。

1.2.3 澳洲堅(jiān)果SAD 生物信息學(xué)分析 利用Vector NTI 軟件進(jìn)行多序列比對，以確定擴(kuò)增的序列為SAD 的基因組序列和編碼框。利用DNAMAN 進(jìn)行開放閱讀框（ORF）分析；利用Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam）在線軟件預(yù)測蛋白的基本物理化學(xué)性質(zhì)；利用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）在線軟件預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)； 利用Clustal X 軟件多序列比對后，并利用ESPipt3.0（ https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ cgi-bin/ESPript.cgi）在線軟件對比對結(jié)果可視化；利用SignalP 5.0在線軟件預(yù)測信號(hào)肽；利用MEGA4 軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 澳洲堅(jiān)果SAD 基因表達(dá)模式分析 利用Taq SYBR Green qPCR Premix ROXⅠ（NOVA）試劑進(jìn)行盒熒光定量PCR，羅氏（Roche）LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量儀器采集熒光數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：SYBR GreenqPCR Mix（2）10.0 μL；特異引物1.0 μL；cDNA模板1.0 μL；ddH2O 補(bǔ)足至20.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸10 s，45 個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熒光信號(hào)的采集，所有循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析（65～95℃）。采集數(shù)據(jù)，計(jì)算基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅(jiān)果總RNA 提取吸光度檢測結(jié)果顯示，葉片總RNA 的A260/A280 為1.82；其凝膠電泳結(jié)果顯示，28S 和18S條帶清晰，28S 條帶亮度約為18S 的2 倍，無彌散條帶（圖1A）。結(jié)果表明提取的總RNA 質(zhì)量較好，純度較高，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 MiSAD 編碼框序列的克隆

凝膠電泳結(jié)果顯示，MiSAD 編碼框序列引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物大小約在1000 bp 左右（圖1B），與SAD 基因CDS 序列大小接近。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的序列為1224 bp。經(jīng)分析，擴(kuò)增片段包含一個(gè)最長1191 bp 的編碼框，編碼396 個(gè)氨基酸，命名為MiSAD。經(jīng)測序后比對，與NCBI 公布的的粗殼種MtSAD（登錄號(hào)為GU595455.1）及LIN等[7]公布的MiFAB 2.12 序列一致，沒有缺失、插入及位點(diǎn)突變。

2.3 MiSAD 基因組序列的克隆

凝膠電泳結(jié)果顯示，MiSAD 基因組序列引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物大小在6000 bp 左右（圖1B），分析發(fā)現(xiàn)MiSAD 基因gDNA 序列長度為5923 bp，由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成（圖2）。

比較發(fā)現(xiàn)，MiSAD 基因與擬南芥SSI2 基因和亞麻芥SAD 家族基因結(jié)構(gòu)總體相似，都包含3 個(gè)外顯子2 個(gè)內(nèi)含子（圖2）。澳洲堅(jiān)果的SAD 基因外顯子1（Ex1）含126 bp，而擬南芥和亞麻芥的均為141 bp，有細(xì)微差異。外顯子2 和外顯子3長度基本一致，并且序列相似度也較高，為植物SAD 基因的保守區(qū)域。其次，澳洲堅(jiān)果的2 個(gè)內(nèi)含子長度分別為4054 bp 和677 bp，明顯大于擬南芥SSI2 和亞麻芥SAD1、SAD2 和SAD3 基因的1088～1145 bp 和76～78 bp。

2.4 澳洲堅(jiān)果SAD 的理化性質(zhì)與二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白理化分析結(jié)果顯示，澳洲堅(jiān)果SAD 分子式為C2024H3162N546O598S16，總原子數(shù)6346，預(yù)測的分子量約為45.22 kDa，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.93，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為56，正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）為50 個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為40.1，脂肪族氨基酸指數(shù)為79.34，總平均親水性系數(shù)為?0.446，推測該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。

利用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫預(yù)測澳洲堅(jiān)果SAD 蛋白的結(jié)構(gòu)域和保守位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)具有2 個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域（圖3），一個(gè)是?；?ACP 脫飽和酶家族；另一個(gè)是類鐵蛋白家族。保守區(qū)中存在6 個(gè)氨基酸的金屬離子結(jié)合基序、多個(gè)酶活性位點(diǎn)及亞基結(jié)合位點(diǎn)。

利用在線工具PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測澳洲堅(jiān)果SAD 酶的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該酶主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主（圖4），并且在第176～179 和第262～265的殘基上存在2 個(gè)E-X-X-H 組氨酸富集區(qū)，為二鐵離子提供結(jié)合位點(diǎn)，形成SAD 酶的活性中心。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測中存在螺旋- 轉(zhuǎn)角- 螺旋結(jié)構(gòu)（HTH），與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。SignalP 5.0和DeepLoc-1.0 在線預(yù)測結(jié)果顯示，澳洲堅(jiān)果SAD序列不存在信號(hào)肽，為非分泌的膜結(jié)合蛋白。

2.5 澳洲堅(jiān)果SAD 多序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI 將推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行blastp 分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果SAD 與其他很多物種的SAD 具有較高的同源性，其中與澳大利亞分布的同為山龍眼科的蒂羅花同源性最高達(dá)94.2%，與木薯同源性也較高為89.9%，葡萄89.4%，荷花89.1%，油茶88.6%，木油桐88.9%，其他物種的SAD 同源性也均在80% 以上。選取荷花（XP_010242709.1， XP_010245693.1）；澳洲堅(jiān)果（ADE06393.1）；葡萄（XP_002274708.2）；木薯（XP_021610569.1）；烏桕（ABN13874.1）；木油桐（ABU50334.1）；克萊門柚（XP_006442769.1）；山桐子（QDX46951.1）；貓爪藤（AHN16186.1，AHN16187.1）；咖啡（XP_027164486.1）；黃麻（OMO62182.1）；木本棉（XP_017648973.1）；棗（XP_015870024.1）；油茶（QID89772.1）；向日葵（CAC80359.1）；大豆（AAA92462.1）；油橄欖（AAB67840.1）；蓖麻（NP_001310659.1）；擬南芥（AAL90985.1）等19 個(gè)物種的21 個(gè)SAD的氨基酸序列，進(jìn)行多重比對發(fā)現(xiàn)，澳洲堅(jiān)果SAD與其他植物的SAD 序列在功能結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性，但在N 端和C 端的氨基酸殘基上有較明顯的差異（圖5）。